检测甲霜灵残留的试纸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测甲霜灵残留的试纸及其应用，具体涉及一种用于检测甲霜灵 残留的胶体金试纸，其特别适用于烟草中甲霜灵的定性检测。
【背景技术】
[0002] 甲霜灵（Metalaxyl)，D, L-N_(2, 6-二甲基苯基）-N_(2'-甲氧基乙酰）丙氨酸甲 酯，是一种新型的具有保护和治疗作用的内吸性杀菌剂，可被植物的根、茎、叶吸收，并随 植物体内水分运转而转移到植物的各器官，可以作茎叶处理、种子处理和土壤处理，对霜霉 菌、疫霉菌、腐霉菌所引起的病害有效，在农业生产上常用来治疗葡萄霜霉病、黄瓜霜霉病、 黄瓜角斑病、辣椒疫病、烟草黑胫病、马铃薯晚疫病、番茄晚疫病、水稻立枯病、水稻青枯病、 水稻恶苗病、玉米茎基腐病、玉米丝黑穗病、谷子白发病等病害，在农业生产和管理中，用途 广泛。
[0003] 甲霜灵属苯基酰胺类，高效、低毒、低残留农药，其内吸和渗透力很强，施药30分 钟即可在植物体内上下传导，对病害植株有保护和治疗作用，且药效持续期长，故残效期 长，从而造成其在农作物上的残留。我国针对不同作物，制定了甲霜灵最大残留限量标准， 其中黄瓜、辣椒、番前的最大残留限量为0. 5mg/kg,糙米的最大残留限量为0. lmg/kg，其他 谷物最大残留限量为〇. 〇5mg/kg。在实际生产中，以2mg/kg作为烟草最大残留量判定标准。
[0004] 从现有技术和相关检测标准看，目前针对甲霜灵残留的检测方法主要是仪器方 法，最常用的方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优 势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂 贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，所以限制了其应用；胶体金免疫层析法具 有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，是理想 的快速筛选手段，能够更好地满足现场快速检测的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便、成本低、检测时间短的甲霜灵残 留检测试纸。
[0006] 本发明所提供的检测甲霜灵残留的试纸，包括样品吸收垫（1)、结合物释放垫 (2)、反应膜（3)、吸水垫（4)和底板（7);所述反应膜上具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白 偶联物的检测线（T线）（5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（6)，所述结合物释放 垫（2)包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物。
[0007] 所述甲霜灵偶联抗原是由甲霜灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述甲霜灵半抗原 是由水解反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋 白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。
[0008] 所述甲霜灵单克隆抗体是以甲霜灵药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制 备获得；所述羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物中的羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到 的。
[0009] 所述样品吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反应膜（3)、吸水垫（4)依次粘贴在底板 (7)上，所述结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0010] 所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为玻纤、无 纺布、滤血膜等；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所 述保护膜为PE材质保护膜。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸的方法，其包括步骤： 1) 制备包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫（2); 2) 制备具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体 的质控线的反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成 试纸。
[0012] 具体地说，步骤包括： 1) 半抗原制备：甲霜灵溶于乙醇中，常温下搅拌加入10% NaOH水溶液，用TLC薄层板 监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，净化，甲醇重结晶，得水解产物，经 核磁、红外和质谱鉴定，甲霜灵半抗原合成成功； 2) 将甲霜灵半抗原与载体蛋白偶联，得到甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物； 3) 用甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融 合、筛选，得到甲霜灵单克隆抗体； 4) 提取小鼠 IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体； 5) 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； 6) 将步骤3)制备的甲霜灵单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到甲霜灵单克 隆抗体-胶体金标记物； 7) 将甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37 °C烘60min后取出， 密封并置于干燥环境中保存备用； 8) 甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线（T线)，并将羊抗鼠抗 抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）； 9) 将样品吸收垫用含0. 5%牛血清白蛋白（体积百分含量)、pH为7. 2、0. lmol/L磷酸盐 缓冲液浸泡2h，37°C下烘干2h ; 10) 在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖 住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，密封包装，4-30°C条件下可保存12个 月。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸检测茶叶、烟草、蔬菜样本中甲霜 灵残留的方法，它包括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用试纸进行检测； (3) 分析检测结果。
[0014] 本发明的甲霜灵快速检测试纸采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析 技术，将甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的甲霜灵在流 动过程中，先与结合物释放垫上的甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物，形成药物-抗体-胶 体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合 甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品 液中甲霜灵残留量，检测限为2mg/kg。
[0015] 检测时，样品经处理后滴入试纸卡孔内，当甲霜灵在样品中的浓度低于检测限或 为零时，甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的甲霜灵半 抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T线)和质控线（C线)内各出现一条红色条带；如果 甲霜灵在样品中的浓度等于或高于检测限，甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物会与甲霜灵 全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出 现红色条带。如图3所示。
[0016] 阴性：当质控线（C线）显示出红色条带，检测线（T线）同时也显示出红色条带，判 为阴性。
[0017] 阳性：当质控线（C线）显示出红色条带，而检测线（T线）不显色，判为阳性。
[0018] 无效：当质控线（C线)不显示出红色条带，则无论检测线（T线)显示出红色条带与 否，该试纸判为无效。
[0019] 本发明的试纸具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种 单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸检测甲霜灵残留的方法简便、快速、直 观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
【附图说明】
[0020] 图1 :甲霜灵半抗原合成路线图； 图2 :试纸剖面结构示意图； 图3 :试纸检测结果判定图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0022] 实施例1甲霜灵检测试纸的制备 该试纸的制备方法主要包括以下几个步骤： 1) 制备包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫； 2) 制备具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体 的质控线的反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成 试纸。
[0023] 下面分步详细叙述： 1、甲霜灵半抗原的制备 甲霜灵溶于乙醇中，常温下搅拌加入10% NaOH水溶液，用TLC薄层板监测反应进行，直 至没有原料或原料点很浅，停止反应，净化，甲醇重结晶，得水解产物，经核磁、红外和质谱 鉴定，甲霜灵半抗原合成成功。
[0024] 2、免疫原制备--甲霜灵半抗原与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到免疫原。
[0025] 称取26. 5mg半抗原溶解于2mL DMF溶液中，加入各60mg EDC和NHS (溶于2mL水 中）进行活化30分钟，加入到110-264mg载体蛋白BSA (溶于5mL水中）进行偶联制备出免 疫原，用0. 02mol/L PB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物 质；透析完成后用于动物免疫制备出抗体。分装，于_20°C保存备用。
[0026] 3、包被原的制备 取12mg甲霜灵半抗原用0. 8ml DMF溶解，冷却至10°C，得到反应液I ;取氯甲酸异丁 酯IOul加入I中，10°C搅拌反应30min ;取30mg牛血清蛋白用2. 2ml 50mmol/L Na2CO3溶 解，10°C反应4h，然后4°C过夜；用0. 01mol/L PBS 4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去 未反应的小分子物质，即得到甲霜灵包被原，分装，于-20°C保存备用。
[0027] 4、甲霜灵单克隆抗体的制备方法 (1)动物免疫 将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生抗血 清。
[0028] (2)细胞融合和克隆化 小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1 (数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞 融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克 隆化，直到得到分泌甲霜灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0029] 细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制