一种特殊糖肽富集和鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化分析领域，具体的说，是一种通过化学标记，实现一类特殊糖肤的 富集和鉴定。
【背景技术】
[0002] 蛋白的糖基化修饰是生物体内最常见、最重要的一种翻译后修饰，与细胞粘附、蛋 白折叠、信号传导和免疫应答等众多生物学过程密切相关。近些年来，在大规模的糖蛋白质 组学的研究中，高效的糖蛋白/糖肤富集技术结合多维色谱分离技术W及高分辨的质谱的 应用，极大的增强了糖组学的动态范围和检测限，越来越多的糖基化位点和糖蛋白能够被 检测。然而，原始糖肤（包含糖链）的大规模鉴定仍然是一个挑战。因此，目前基于质谱的 糖蛋白组学研究通常要先对糖蛋白/糖肤进行去糖基化的处理。
[0003] 由于酶促去糖基化的高特异性和高选择性。近些年来，人们发现并发展了 一批具有较强特异性的去糖基化酶，如PNGaseA、PNGaseF、化doF和化doΗ等 (R.A. 0' 化ill,JournalofQiromatogra地yA, 1996, 720, 201)。其中PNGaseF由于其较 强的去糖基化活性和普适性，在糖蛋白组学中得W广泛使用化F.Zielinska，F.Gnad，J. R.Wi^iewskiandM.Mann,Cell, 2010, 141，897)。早期的一些文献曾报道PNGaseF 对于糖基化的天冬氨酸位于肤段N-或C-末端的糖肤具有较差的去糖基化活性（J.-化FanandΥ.C.Lee,JournalofBiologicalChemistry,1997, 272, 27058 ；T.Plummerand A.Tarentino,JournalofBiologicalQiemistry, 1981, 256, 10243)。然而，PNGaseF的 送种歧视效应在当前的研究中却被广泛忽视。
[0004] 基于该现象，我们提出了一种对送种特殊的糖肤的N端进行选择性标记的方法。 通过标记，使PNGaseF能够识别被选择性标记的送种特殊糖肤，从而释放其糖链。在后续 的质谱分析中，添加相关标记的可变修饰，即可获得鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服PNGaseF对送种特殊糖肤的歧视效应，通过对送种特殊糖肤进行 N端选择性标记形成醜胺键，从而使送种糖肤能够被PNGaseF识别，从而顺利的释放糖链， 通过质谱分析并得到鉴定。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 首先利用蛋白酶对蛋白进行酶解得到肤段混合物，然后通过糖肤富集技术对肤段 混合物进行富集得到糖肤，并对糖肤进行充分的酶促去糖基化。随后再次利用糖肤富集技 术获得上述样品中未被去糖基化的糖肤，并对其氨基端进行化学标记，形成新的醜胺键，并 重新进行酶促去糖基化，从而在质谱上获得鉴定。
[0008] 所述的酶解、富集、标记和去糖基化详细说明如下：
[000引 （1)酶解；将蛋白进行变性还原烷基化后，利用蛋白酶，如膜蛋白酶（trypsin)、丝 氨酸蛋白酶Qys-c)和蛋白内切酶（glu-c)，37°C条件下对蛋白进行酶解l-24h;
[0010] (2)富集；糖肤富集技术包含亲水作用色谱法、醜阱化学法或凝集素富集法等能 从肤段混合物中富集得到糖肤的技术；
[0011] (3)标记；用一种标记试剂对特殊糖肤的N端进行标记，其中标记试剂为；可与N 端α氨基形成醜胺键的酸酢类（如己酸酢、丙酸酢、了二酸酢）、駿基活化类（如N-居基了 二醜亚胺、4-二甲氨基化巧）、氨基酸类（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）中的一种试剂；
[0012](4)去糖基化条件：在合适的条件下（ρΗ7. 5-8. 5)，加入一定量糖巧酶（如PNGase F)，37°C下赔育l-12h。
[0013] 与传统糖肤富集相比，本发明具有W下优点：
[0014] (1)本发明操作简单，只需要额外进行一步标记和去糖基化即可获得对特殊糖肤 的鉴定；
[0015] (2)本发明可W克服糖巧酶（如PNGase巧对于糖链位于肤段氨基末端送类糖肤 的歧视效应，顺利切除其糖链；
[0016] (3)本发明鉴定到的特殊糖肤对于传统方法是一个较大的补充。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的原理图；
[0018]图2为利用传统方法对核糖核酸酶B的糖肤进行去糖基化的产物；
[0019] 图3为利用特殊方法对核糖核酸酶B的糖肤进行标记后再去糖基化的产物；
[0020] 图4为策略A和B鉴定到的各类糖肤占总糖肤的比例；
【具体实施方式】
[0021] W下提供本发明一种富集和鉴定特殊糖肤的【具体实施方式】。
[0022] 实施例1
[0023] 标准糖蛋白核糖核酸酶B(RNaseB)中特殊糖肤（糖基化的天冬氨酸位于糖肤的 N末端）的富集和鉴定。
[0024] 首先利用膜蛋白酶对RNaseB进行酶解，得到RNaseB的酶解产物。然后利用亲 水相互作用色谱柱对一份RNaseB的酶解产物进行糖肤的富集，然后加入PNGaseF进行 去糖基化处理，对产物进行MLDI-T0F分析，见图2。利用亲水相互作用色谱柱对另一份 RNaseB的酶解产物进行糖肤的富集，然后对糖肤的N端进行了二酸酢的标记。接着重新加 入PNGaseF进行去糖基化，得到标记的去糖基化的肤段，最后进行MLDI-T0F的分析鉴定， 见图3。
[00巧]亲水相互作用色谱柱（ClickmaltoseHILIC) ;300μmi.d.X5cm;
[0026] 富集条件；上样条件为ACN-H2O-S氣己酸灯FA) = 80-20-0. 1 ;洗脱条件为 ACN-H2O-TFA= 50-50-0. 1 ；
[0027] 去糖基化条件：去糖基化缓冲液为50mM的抑=8. 5的畑4肥〇3;PNGaseF的加入 量按照Img肤段对应500units的比例加入，37摄氏度反应12h;
[0028] 标记条件；20mM了二酸酢的磯酸缓冲液巧OmM,pH7. 5)，标记时间为5min。
[002引由图2所示，质荷比为1033.6的峰为肤段SRN#wLTKDR去糖基化后的肤段，而质荷 比为2005. 4的峰及后面4个的质荷比相差162的峰为肤段N#wLT邸R所代表的糖化每个 产物相差一个甘露糖（162化）。说明肤段SRN#wLT邸R的糖链能够被PNGaseF进行去糖基 化，而肤段N#wLTKDR上的糖链却不能被去糖基化。
[0030]由图3所示，质荷比为890.6的峰为肤段N端标记了一个了二酸酢（lOODa)的去 糖基化的肤段N#wLT邸R;质荷比为1133.6的峰为肤段N端标记了一个了二酸酢（lOODa)的 去糖基化的肤段SRN#wLT邸R。说明前者经过了二酸酢的标记，能够被PNGaseF识别从而释 放糖链，而在图2中由于未被标记无法释放糖链，说明N端了二酸酢标记对于该类糖肤糖链 的释放十分必要。
[00引]实施例2
[0032] 海拉细胞蛋白酶解产物中特殊糖肤的富集和鉴定。
[0033] 将海拉细胞的膜蛋白酶酶解产物通过亲水相互作用色谱柱进行糖肤的富集，然后 加入PNGaseF在合适的条件下进行去糖基化。将去糖基化的产物分为等量的两份。一份 直接进行质谱分析，即传统的策略A。另一份重新通过亲水相互作用色谱对未糖基化的糖肤 进行二次富集，然后加入适量的了二酸酢进行N端标记，最后加入PNGaseF进行去糖基化 及后续的质谱分析，即策略B。并将两次质谱分析的结果（A和B)加W比较，见图4。亲水 相互作用色谱柱、富集、去糖基化和标记条件如实施例1所述。
[0034] 如图4,策略A中一共鉴定到1135条糖肤，而糖基化的天冬醜胺位于肤段首位的 糖肤只有47条，占所有糖肤的4.1%。其他位置（从肤段N末端开始为0,即N端）如位置 1-5的糖肤比例约10 %左右。策略B中，位于0号位糖肤有73条，占策略B中糖肤的75. 2% (73/97)，即超过四分之Η的糖肤为该特殊类型的糖肤，而在策略A中，其含量只占4. 1 %。 说明绝大多数的该特殊糖肤在策略A中未被鉴定到，归因于传统方法中送类糖肤未能被有 效去糖基化。而在策略B中，通过对送类糖肤的有效富集，并通过N端了二酸酢标记，从而 获得充分的去糖基化并得到鉴定。此外，通过对数据分析发现，策略B中获得鉴定的送类特 殊糖肤都带上了N端的了二酸酢的标记，标记效率为100%，充分说明送类糖肤是因为被标 记才得W被PNGaseF识别，从而在酶的作用下发生有效的去糖基化。策略B在鉴定送类特 殊糖肤方面，在数量和选择性上都大大优于传统方法，通过合并策略A和B的结果，能将送 类特殊糖肤占所有糖肤的比重从原来的4. 1%左右提升到8. 3%，说明该方法是对传统糖 肤鉴定方法的一个较大补充。
【主权项】
1. 一种富集和鉴定特殊糖肽的方法，其特征在于： 1) 首先通过糖肽富集技术从蛋白的酶解产物中得到糖肽； 2) 然后利用标记试剂与糖肽的N端进行反应，待反应完成后，除去标记试剂，加入糖苷 酶进行充分去糖基化，最后对其进行质谱鉴定。2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：糖肽富集技术是亲水作用色谱法、酰肼化 学法或凝集素富集法中的一种或二种以上。3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：酶解产物是胰蛋白酶（trypsin)、丝氨酸 蛋白酶（lys-c)或蛋白内切酶（glu-c)中的一种或二种以上对蛋白进行酶解后的产物。4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：糖苷酶是肽N-糖苷酶A(PNGaseA)和肽 N-糖苷酶F(PNGaseF)中的一种或二种。5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：标记试剂是与ct氨基发生高选择性反应 同时生成酰胺键的试剂。6. 按照权利要求5所述的能与α氨基发生高选择性反应同时生成酰胺键的试剂包括： 酸酐类试剂（如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐）、羧基活化类试剂（如Ν-羟基丁二酰亚胺、4-二 甲氨基吡啶）以及氨基酸类试剂（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）。7. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的质谱可以是飞行时间类质谱或离 子阱类质谱中的一种或二种。8. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖肽的糖基化的天冬氨酸位于糖肽Ν 末端。9. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)为了提高质谱检测的灵敏度，首 先通过糖肽富集技术从蛋白的酶解产物中得到糖肽，然后利用糖苷酶对糖肽进行充分的去 糖基化，再利用糖肽富集技术获得未被去糖基化的糖肽。
【专利摘要】本发明属生化分析领域，涉及一种特殊糖肽富集和鉴定的方法。利用反应试剂与这类特殊糖肽(其糖基化的天冬氨酸位于糖肽的N末端)的N末端的氨基反应形成酰胺键，从而使该糖肽能够被常用的糖苷酶(PNGase？F)识别并释放其糖链，进而通过质谱分析获得鉴定。该方法操作简单，省时，高效。通过该方法，可以将天冬氨酸末端的糖肽的鉴定数目提高一倍以上，是对传统糖肽鉴定结果的一个较大补充。
【IPC分类】G01N27/62, G01N1/40, G01N1/28
【公开号】CN105277398
【申请号】CN201410261978
【发明人】张丽华, 翁叶靖, 蒋好, 随志刚, 杨开广, 张玉奎
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年6月12日