检测dera酶催化醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种酶催化效率的检测方法，具体设及一种检测DERA酶催化醒缩反 应液中氯乙醒含量及催化效率的方法。
【背景技术】
[0002] 他汀类药物是降血脂主要药物，其结构中均带有侧链（3R，5S)-二径基醋结构，该 结构可作为甲径戊二酸单酷辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，抑制HMG-CoA向甲径戊酸的还 原性转化，进而降低低密度脂蛋白胆固醇的水平，从而达到降低血脂的目的。
[0003] 他汀类药物虽然化学结构相对简单，但其制备过程难度较大，原因有两个，一是侧 链（3R，5S)-二径基醋具有2个手性中心难W通过一步反应完成；二是侧链（3R，5S)-二径 基醋在他汀类分子中的对映体过量（e.e.)和非对映体过量（d.e.)值分别大于99. 5%和 99%，使得对映体的拆分比较困难。运些因素都导致他汀类药物侧链合成产率较低，成本较 局。
[0004] 生物催化是解决当前问题的重要途径。目前，已经发现有生物酶对径醒缩合反应 有催化效果，其中醒缩酶DERA能够催化乙醒和氯乙醒的连续醒缩反应，生成带有两个手性 中屯、的6-氯-(3R，5S)-二径基醒，在他汀类药物合成中具有巨大的潜在应用价值。
[0005] 但不同的生物酶，甚至不同来源的DERA酶，对连续醒缩反应的催化效果均不相 同。在寻找催化效果更佳的DERA酶的过程中，就需要对其产物进行检测，W评价DERA酶的 催化效率。然而，由于利用DERA酶催化连续醒缩反应时，对其产物的检测非常困难，一般需 要用到气相色谱等仪器，对仪器要求高，检测成本高，从而严重限制了改进DERA酶催化性 能的研究。
[0006] 通过检测DERA酶催化连续醒缩反应的上清液中未反应底物的含量，可W得出参 与催化反应的底物的消耗量，从而可获得DERA酶的催化效率。
[0007] 对于甲醒、乙醒等幾基化合物的检测方法，一般是先将甲醒在酸性条件下与2， 4-二硝基苯阱反应，生产稳定的2,4-二硝基苯腺；然后可经环己烧萃取，用配有电子波或 检测器的气相色谱仪测定2,4-二硝基苯腺的含量，得出甲醒的含量；还可将2,4-二硝基苯 腺置于碱性条件下生成有色的酿类化合物，并在430皿左右波长下利用比色法测定酿类化 合物的吸光度，也可W计算出甲醒的含量。
[0008] 但DERA酶催化连续醒缩反应的反应体系中，含有乙醒和氯乙醒两种幾基化合物， 乙醒和氯乙醒均能依次与2,4-二硝基苯阱、碱液发生反应，生成栋红色化合物。在测量含 有两种栋红色化合物的样本待测液的吸光度时，本发明人发现，在430nm左右波长下测量 时，检测结果极不稳定，准确率较差。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种检测DERA酶催化连续醒缩反应液中氯乙醒含量的方法，该方 法具有检测结果准确、检测灵敏度高等特点。
[0010] 一种检测DERA酶催化连续醒缩反应液中氯乙醒含量的方法，包括W下步骤：
[0011] (1)取反应上清液，加入2,4-二硝基苯阱，在酸性条件下进行反应，获得样本反应 液；
[0012] (2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液； 阳01引 做在520~535nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清 液中氯乙醒的含量。
[0014] 传统方法在检测溶液中幾基化合物的含量时，一般是在430nm左右波长下测量样 本待测液的吸光度。但本发明的上清液中含有乙醒和氯乙醒两种幾基化合物，乙醒和氯乙 醒均能依次与2,4-二硝基苯阱、碱液发生反应，生成栋红色化合物。在测量含有两种栋红 色化合物的样本待测液的吸光度时，发明人发现，在430nm左右波长下测量时，检测结果极 不稳定，准确率较差。运是因为乙醒参与反应生成的栋红色化合物A，其特异性吸收峰在 438nm处，而氯乙醒参与反应生成的栋红色化合物B，其特异性吸收峰却在520~535nm，运 是出乎本领域技术人员常规认知之外的。同时栋红色化合物B在430nm波长下也具有与栋 红色化合物A相近的吸收峰，两者的吸收峰彼此覆盖，使得在430nm左右波长下测量样本待 测液的吸光度时，测量结果不准确。而本发明在520~535nm下测量样本待测液的吸光度， 在该波长下只有栋红色化合物B的吸收峰，测量结果稳定、准确率和灵敏度均大大提高。
[0015] 具体地，所述方法包括：
[0016] (1)取反应上清液，加入2,4-二硝基苯阱，在酸性条件下进行反应，获得样本反应 液；
[0017] 作为优选，2,4-二硝基苯阱的终浓度为0. 0025 %~0. 005%，更为优选的终浓度 为0. 005%。根据本领域技术人员的常规认知，2,4-二硝基苯阱的加入量应为过量，大于反 应液中乙醒与氯乙醒的总量。
[0018] 作为优选，上清液与2,4-二硝基苯阱的反应时间为10~30min;更优选的反应时 间为20min。
[0019] (2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液；
[0020] 作为优选，加入碱液后至抑为8~9。 阳021] 作为优选，样本反应液与碱液的反应时间为5~20min;更优选的反应时间为 10min〇 阳02引 做在520~535nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清 液中氯乙醒的含量；
[0023] 作为优选，在528nm波长下测量样本待测液的吸光度，因栋红色化合物B的最大吸 收峰在528nm处。
[0024] 所述标准曲线的建立方法为：
[0025] (a)制备一组氯乙醒浓度呈梯度分布的标准品；
[00%] 化）取各标准品，加入2,4-二硝基苯阱，在酸性条件下进行反应，再加入碱液继续 反应，获得标准品待测液；
[0027] (C)在520~535皿的波长下测量标准品待测液的吸光度；
[002引 （d)根据氯乙醒浓度与吸光度绘制标准曲线。
[0029] 本发明还提供了一种快速检测DERA酶催化效率的方法，包括W下步骤：
[0030] (1)在反应体系中加入DERA酶、乙醒和氯乙醒，经催化反应后取上清液；
[0031] (2)利用上述的方法检测上清液中氯乙醒的含量；
[0032] (3)计算得到DERA酶的催化效率K;
[0033] K= (A-B)/AX100%
[0034] A为反应体系中氯乙醒的初始量，B为催化反应后反应体系中氯乙醒的量。
[0035] 本发明通过检测上清液中未参与催化反应的氯乙醒的含量，计算出氯乙醒参与催 化反应的消耗量，通过反应底物的消耗量来反映DERA酶的催化效率K。在相同的催化条件 下，氯乙醒的消耗量越大，说明该DERA酶的催化效率越高，反之，则说明DERA酶的催化效率 越低。
[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0037] 本发明发现氯乙醒与乙醒等其他常规幾基化合物不同，氯乙醒依次与2,4-二硝 基苯阱、碱液发生反应生成的栋红色化合物B，其特异吸收峰在528nm处；在528nm下测量 样本待测液的吸光度时，在该波长下只有栋红色化合物B的吸收峰，不存在栋红色化合物 A(乙醒依次与2,4-二硝基苯阱、碱液发生反应生成）的干扰，测量结果稳定、其准确率和灵 敏度均大大提高。
【附图说明】
[0038] 图1为乙醒与2,4-二硝基苯阱衍生物的光谱扫描结果；
[0039] 图2为氯乙醒与2,4-二硝基苯阱衍生物的光谱扫描结果； W40] 图3为立种DERA酶催化连续醒缩反应活性的定性检测结果；
[0041] 图4为氯乙醒浓度和528nm处吸光度的标准曲线示意图。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步说明。 阳0创 1、溶液配制
[0044] (1)2,4-二硝基苯阱溶液（0. 1% ):取2,4-二硝基苯阱Ig，加乙醇1000血，使其 溶解，再缓缓加入盐酸lOmU摇匀，即得。
[0045] (2)氨氧化钟溶液（lOOg/L):取lOOg氨氧化钟，加800血蒸馈水溶解，定容至1L， 即得。
[0046] 2、乙醒与2,4-二硝基苯阱衍生物特异性吸收峰的确定
[0047] 在24孔板的Ξ个孔中分别加入对照蒸馈水、0. 5mg/L乙醒溶液、Img/L乙醒溶液 各2血，加入100μL2,4-二硝基苯阱溶液，混