一种基于荧光共振能量转移技术的黑素皮质素受体1药物筛选模型的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用巧光检测技术，构建了一种黑素皮质素受体的药物 筛选模型，用于待测样品对黑素皮质素受体1活性的药物筛选。
【背景技术】
[0002]MCI受体即黑素皮质素受体1(melanocortin1recepto;r，MClR)，运一受体的基因 是控制动物黑色素合成的重要基因，在黑色素细胞、肾上腺皮质细胞、神经系统和免疫系统 中表现出不同的功能。通过控制真黑色素数量来决定动物的毛色，并影响动物的疾病发生。 MC1R基因的突变与黑色素性状变异和皮肤癌等疾病有关。所W建立MC1R激动剂筛选模型 对治疗皮肤癌等疾病具有重要意义。
[0003]LancecAMP方法基于巧光共振能量转移原理，通过检测巧光信号，反映出样品中 环憐酸腺巧（cAM巧含量变化。实验中完整细胞生产的cAMP与反应体系中生物素标记的 cAMP化-cAMP)竞争性的和抗cAMP抗体结合，中断了巧光共振能量转移的过程，造成巧光信 号的减弱，从而反映出化合物是否具有黑素皮质素受体1激动作用。
[0004]MC1R基因在哺乳动物中由extension位点编码，是G蛋白偶联受体（GPCR)家族成 员之一，只有一个编码区，其编码的蛋白质有7个跨膜结构域，主要表达于动物的黑色素细 胞。cAMP是其主要的信号分子，因此MC1R激动剂的筛选适用于LancecAMP方法。
[0005] 目前，已有的黑素皮质素受体1激动剂/括抗剂筛选方法，多利用巧光素酶报告基 因法W及酶联免疫吸附法，但此两种方法费时费力，同时难W应用到高通量筛选。因此，建 立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种基于巧光的黑素皮质素受体1激动剂的药物筛选方 法，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0007] 本发明的技术方案：采用巧光方法建立体外黑素皮质素受体1激动剂的药物筛选 模型，初筛，复筛发现一类具有激动黑素皮质素受体1活性的候选化合物。具体步骤如下：
[0008] 本发明利用巧光的方法建立了一种黑素皮质素受体1激动剂的药物筛选模型。
[0009] 步骤一：细胞培养。
[0010] 步骤二：标准曲线的测定。
[0011] 步骤Ξ:模型验证。
【附图说明】：
[001引 图1 :W配制cAMP标准稀释液对标准曲线的测定。（η= 3，^兰5 )
[001引图2 :Forskolin作用不同细胞数所产生的信号与标准曲线的对比。（η= 3,X兰5 )
[0014] 图3 : (Nle4, D-Phe7) - α -Μ甜可刺激C册稳转细胞株MCI受体产生cAMP且成量效 依赖性。其IC50为1.03X10UM。（n= 3，iAS^)
【具体实施方式】
[0015]W下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[001引细胞株：CH0-MC1
[0017]试剂出am' sF12,10 % FBS，lOOIU/ml penicillin, 100μg/ml str巧tomycin， 400 μg/mlG418，Hank平衡盐溶液（皿SS)，Stimulation Buffer A, Stimulation Buffer B。
[0018] 仪器：二氧化碳培养箱；384孔板；Multi化op加样器；EnVision 2014 Multil油el Reader。
[001引一、细胞培养
[0020] (1)细胞的贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0021] 似用溫和的PBS冲洗细胞一次。
[0022] (3)用0. 05% trysin-lmM邸TA消化细胞。
[002引（4)用ISOO巧m离屯、2分钟。
[0024] (5)停止后用完整培养基冲洗一次。
[002引（6)对细胞计数，取细胞悬液到15ml培养基中，使细胞浓度达到7. 5X105cells/ ml,将此细胞悬液加入到T75培养瓶中，让细胞在37°C/5%C02下过夜W进行培养。
[0026] 二、标准曲线的测定
[0027](1)配制cAMP标准稀释液：cAMP的标准溶液50 μ mol/L(试剂盒自带），逐级稀释 在Stimulate buffer中。
[0028]似配制AlexaFluor⑥647-anti cAMP抗体溶液：AlexaFluor?647-anti cAMP 溶液在Stimulation Buffer中W1 %的比例稀释（如将5μL的抗体液加入到495uL的 Stimulation Buffer中），然后上下倒置混合均匀。
[0029] (3)配制Detection Mix
[0030] a.在cAMP Detection Buffer中稀释标记了链霉素的LANCE化-W8044巧u-SA): 将5μL标记了链霉素的化-W8044巧U-SA)加入到85μL的cAMP Detection Buffer.
[00；31]b.在cAMP Detection Buffer中稀释Biotion-cAMP :将5μL的Biotion-cAMP化-cAMP)加入到25μ1的cAMP Detection Buffer中。
[0032] c.根据W上两步的稀释物来进行混合检测：将615μ1的Detection Buffer加入 到试管中；将5 μ 1的化-W8044稀释物加入到试管中；轻轻地混合；将5 μ 1的b-c AMP稀 释物加入试管中；轻轻地混合；在室溫下至少解育15分钟。
[0033] (4)标准曲线检验步骤
[0034] 实验方法在白色OptiPlate-384 microplates上进行，总体积为20 μ L。
[0035] a.加5μL的cAMP标准稀释物.
[0036] b.加5μL的抗体溶液.
[0037] C.在室溫下解化30-60分钟.
[0038] d.力日10μL的Detection Mix.
[0039] e.将板用TopSeal-A软片盖上并在室溫下解化60分钟.
[0040]f.在TRF检测仪上读取数据.在读取数据前要去掉TopSeal-A.
[00川 g.在检测的灵敏度范围内，阅读可在20小时W内进行。
[004引 S、模型验证
[0043] (1)配制StimulationbufferB: 1X的皿SS中含 5mM肥阳S，0. 1 %BSA，IBMXW 0. 5mmol/L,pH7. 4。
[0044] (2)用非膜酶的消化酶化2g/L的邸ΤΑ溶解于PBS中）消化细胞。W皿SS清洗 细胞一次。
[0045] (3)在StimulationBuffer中重悬细胞使细胞浓度达到3xl〇6cells/mL。将细 胞稀释成ll，500/5yL5,750/5yL2,880/5yLand960cells/5yLW及没有细胞的空 白孔。
[004引 （4)抗体溶液的制备：将5μL的抗体液加入到495μL的StimulationBuffer细 胞悬液中，然后上下倒置混合均匀.
[0047] (5)将化合物溶于StimulationBuffer中制成4X浓度.如果有一种W上的化合 物需要加入（如激动剂-forskolin)。
[0048] (6)LANCEcAMPAssay在optiplate384 孔板中进行，其终体积为 20μ1 :
[0049]a.向孔中加入2. 5μ1 4Χ待测药物。
[0050]b.向孔中加入 2. 5μ1 的StimulationBuffer。
[0051]c.再加入 5μ1 的细胞悬液（包含Alexa-1 油eledantibodies).
[0052]d.室溫解育细胞30-60分钟。
[0053]e.加入10μ1的DetectionMix(配制方法如前）.
[0054]f.用TopSeal-Afilm封板，在室溫下解育 60minutes。
[00巧]g.将封膜摘除，于TRF检测读取数据。
[005引 h. 20小时W内可W进行再次的检测，不影响其灵敏度。
[0057] 化合物稀释：
[005引 （1)将非GPCR依赖型激动cAMP化合物化rskolin使用DMS0配制成50mM母液，W StimulationBuffer逐级稀释为工作浓度的4倍。
[005引 似阳性药为黑素皮质素受体1激动剂（Nle4,D-Phe7) -α-MSH，使用无菌立蒸水 配制成5mg/ml母液，WStimulationBuffer逐级稀释为4Χ药物浓度。
[0060] 实验结果
[0061] 确定激动稳转细胞株黑素皮质素受体1的药物筛选模型造模条件，每孔细胞数为 192cells/μ1，即为960cells/well(图2)，所得到forskolin刺激结果与标准曲线（图1) 趋势最为一致。通过该模型验证了（饥64,0斗}167)-〇-1甜对邸0稳转细胞株黑素皮质素 受体1的激动作用，其IC50为1. 03X10 (图3)。
【主权项】
1. 一种黑素皮质素受体1激动剂的药物筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 细胞培养； (2) 标准曲线的测定； (3) 模型验证。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黑素皮质素受体为黑素皮质素受体 1〇3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行细胞培养，培养条件为：细 胞悬液到15ml培养基中，使细胞浓度达到7. 5X105cellS/ml，将此细胞悬液加入到T75培 养瓶中，让细胞在37°C/5 %C02下过夜以进行培养。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑵中，配制不同浓度的cAMP的标准溶 液，每孔加入5μ1，再每孔加入5μL的抗体溶液，在室温下孵化30-60分钟后，加10μL的 DetectionMix，将板用TopSeal-A软片盖上并在室温下孵化60分钟。在TRF检测仪上读 取数据。在读取数据前要去掉TopSeal-A，在检测的灵敏度范围内，阅读可在20小时以内进 行。经数据统计，确定cAMP标准曲线。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑶配制不同浓度的非GPCR依赖型 激动cAMP化合物Forskolin使用DMS0配制成50mM母液，以StimulationBuffer逐级稀 释为工作浓度的4倍，每孔加入2. 5μ1，向每孔加入2. 5μL的StimulationBuffer，再加 入5μ1的细胞悬液（包含Alexa-labeledantibodies)，在室温下孵化30-60分钟后，加 10μL的DetectionMix，将板用TopSeal-A软片盖上并在室温下孵化60分钟。在TRF检 测仪上读取数据。在读取数据前要去掉TopSeal-A，在检测的灵敏度范围内，阅读可在20小 时以内进行。经数据统计，确定最佳每孔细胞数为960cells/well。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)配制不同浓度的黑素皮质素受体 1激动剂（Nle4,D-Phe7)-a-MSH，使用无菌三蒸水配制成5mg/ml母液，以Stimulation Buffer逐级稀释为工作浓度的4倍。每孔加入2.5μ1，向每孔加入2.5μL的Stimulation Buffer，再加入5μ1的细胞悬液（包含Alexa-labeledantibodies)，在室温下孵化30-60 分钟后，加10μL的DetectionMix，将板用TopSeal-A软片盖上并在室温下孵化60分钟。 在TRF检测仪上读取数据。在读取数据前要去掉TopSeal-A，在检测的灵敏度范围内，阅读 可在20小时以内进行。经数据统计，（Nle4,D-Phe7)-a-MSH对CH0稳转细胞株黑素皮质 素受体1具有激动作用，其IC50为1. 03X10nM，与文献报道一致。7. 权利要求1-6中所述的方法在筛选黑素皮质素受体1活性药物中的应用。
【专利摘要】本发明发现了一种筛选黑素皮质素受体1激动剂的药物筛选方法，本发明基于荧光共振能量转移原理，利用完整细胞生产的cAMP与反应体系中生物素标记的cAMP(b-cAMP)竞争性的和抗cAMP抗体结合，中断了荧光共振能量转移的过程，造成荧光信号的减弱，从而反映出化合物是否具有黑素皮质素受体1激动作用。包括以下步骤：(1)细胞培养；(2)标准曲线的测定；(3)模型验证：阳性药IC50与参考文献一致。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。
【IPC分类】G01N33/533
【公开号】CN105277684
【申请号】CN201510828054
【发明人】严明, 王翔, 高鹏, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月20日