基于磁性分离和量子点标记的人肺炎链球菌快速检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人 肺炎链球菌抗原的快速检测方法及检测试剂盒，W及该检测试剂盒的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002] 人肺炎链球菌（Str巧tococ州Spneumoniae,Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原 体。主要经飞沫传播而进入呼吸道，从而寄生于人体的鼻咽部，或侵入人体不易清除的部位 引起一系列的疾病，如大叶性肺炎，脑膜炎，支气管炎，中耳炎等。它是全球所有年龄组高发 病率和病死率的主要病原菌。其中，在发展中国家，婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为 严重。肺炎链球菌于1881年首次由己斯德化ouis化steur)及G.M.Sternberg分别在法 国及美国从患者姨液中分离出。其为革兰氏染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列 的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的芙膜。其芙膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型 的依据。根据芙膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。肺炎链球菌菌体抗原 主要为C多糖，其存在于肺炎链球菌细胞壁中，具有种特异性，为各型菌株所共有。C多糖 可被血清中C-反应蛋白沉淀。在巧离子存在时，C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋 白（Creactiveprotein,CRP)的目球蛋白结合，发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原 的检测亦主要是针对此抗原，而该抗原非肺炎链球菌独有，如缓和链球菌亦含有该抗原。在 肺炎链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原，为肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)，其存在 于肺炎链球菌所有血清型中，是肺炎链球菌的特异性抗原。但是PspA分子结构高度变异， 具有抗原多样性，其富含脯氨酸的结构域上游被称为CDR域，具有多样性。根据CDR域的不 同将PspA分为 3 个家族 6 亚类；Cladel，Clade2,Clade3,Clade4,Clade5,Clade6。其中 Cladel,Clade2 属于Faml家族；Clade3,Clade4,Clade5 属于Fam2 家族，Clade6 属于Fam3 家族。具有Faml或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎链球菌占到了临床分离的人肺炎链球菌 种类的99%W上。我国目前还未见具有fam3家族PspA蛋白的肺炎链球菌的临床分离报 道。研究表明同一家族亚类间PspA蛋白间存在广泛的抗原抗体交叉反应，而异家族亚类间 则无此交叉反应。
[0003] 临床病人由于不同的呼吸道病原体（如副流感病毒、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病症状可W十分相似，送导致了流行诊断比较困难， 确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可W得到明 确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
[0004] 尽管肺炎链球菌在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊 断的标准化商品试剂的种类极少。目前，肺炎链球菌的检测主要有W下几种方法：
[0005] -、常规实验室检测
[0006] 1、细菌分离
[0007] 实验室诊断肺炎链球菌的金标准是分离人肺炎链球菌毒株。采用鼻咽分泌物作为 病原体分离的标本，可w用血培养的方法分离病原体。但是该法有严重的缺陷，因为肺炎链 球菌是苛养菌，营养要求高，培养所需时间长，阳性率低，更重要的是，若采样前患者使用过 抗菌药物，会造成培养结果的假阳性。送样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。 [000引 2、血清学检测
[0009] 即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫英光法等，检测被检者血清中肺炎链球菌抗 体水平，可间接提示肺炎链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊 断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人肺炎链球菌抗体 效价比急性期高4倍或4倍W上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，且因为菌 体血清型种类过多，导致其诱生的抗芙膜多糖抗体种类过多，对抗体的检测造成了很大的 困难，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。
[0010] 二、快速诊断
[0011] 直接检查人肺炎链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有 胶体金免疫层析法、免疫英光法、免疫酶法和PCR法等。免疫英光法和免疫酶法均存在操作 步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长（2hW上），成本较高等缺点。PCR方法快速、灵 敏、特异，是目前研究肺炎链球菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备W及操作要求较 高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。胶体金免疫层析法的检测目 标抗原为C多糖抗原，但是胶体金法敏感度较低，对样品材料质量要求较高，同时还存在与 其他链球菌如缓和链球菌存在交叉反应等缺陷。因此，建立具备高灵敏度的人肺炎链球菌 特异性抗原快速诊断法十分必要。
【发明内容】
[0012] 针对【背景技术】中存在的送些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点 标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人肺炎链球菌抗原的检测方法和试剂盒，W及该试剂 盒的制备及使用方法。
[0013] 本发明是通过W下技术方案来实现的：
[0014] 一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎链球菌抗原的方法，其特征在于： 所述该方法包括W下步骤：
[001引1)兔抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体的制备；
[0016] 2)鼠抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体的制备；
[0017] 如将步骤1)巧[J备的兔抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体分别 与纳米磁珠通过共价偶联，分别制备抗人肺炎链球菌FamlPspA蛋白免疫纳米磁珠及抗人 肺炎链球菌Fam2PspA蛋白免疫纳米磁珠，将抗人肺炎链球菌FamlPspA蛋白免疫纳米磁珠 及抗人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白免疫纳米磁珠等量混合即制得抗人肺炎链球菌免疫纳米 磁珠；
[001引 4)将步骤2)制备的鼠抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体分别 与纳米量子点通过共价偶联，分别制备量子点标记的人肺炎链球菌FamlPspA蛋白纳米探 针W及量子点标记的人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白纳米探针，将量子点标记的人肺炎链球 菌FamlPspA蛋白纳米探针W及量子点标记的人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白纳米探针等量混 合即制得量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针；
[0019]5)取人呼吸道分泌物样本（包括但不限于咽拭子），用PBST缓冲液溶解后，加入 步骤3)制备得到的抗人肺炎链球菌免疫纳米磁珠，充分混合，反应15-45min后进行磁分 离，WPBST缓冲液洗涂2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4)制备得到的量子点 标记的抗人肺炎链球菌纳米探针，反应25-45min后进行磁分离，WPBST缓冲液洗涂2遍 后，使用英光酶标仪读取英光值；所述PBST缓冲液中各组分含量分别为8g/L化化，0. 2g/L KC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/L胞2册〇4,0. 5ml/LTween-20,所述PBST缓冲液的抑=7. 4 ;
[0020] 6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为人肺炎链球菌阴性的 人群的呼吸道分泌物样品，读取英光值；所述人肺炎链球菌阴性的人群的呼吸道分泌物样 品简称人肺炎链球菌阴性对照样品；所述四份人肺炎链球菌阴性对照样品的英光值的平均 值与3倍标准差之和即为CUT-OFF值；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测英光值大于 CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人肺炎链球菌抗原为阳性；若步骤5)中人呼 吸道分泌物样本的检测英光值小于CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人肺炎链 球菌抗原为阴性。
[0021] 一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎链球菌抗原的试剂盒，其特征在 于：所述基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎链球菌抗原的试剂盒由具有富集人肺炎 链球菌功能的抗人肺炎链球菌免疫纳米磁珠、量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针、质 控品W及PBST缓冲液所组成；所述质控品包括阳性质控品W及阴性质控品；所述阳性质控 品由灭活的人肺炎链球菌干燥结合到拭子上而成；所述阴性质控品是经临床确定为人肺炎 链球菌阴性的人群的咽拭子。
[0022] -种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎链球菌抗原的试剂盒的 方法，其特征在于：所述制备方法包括W下步骤：
[0023] 1)抗人肺炎链球菌免疫纳米磁珠的制备：
[0024] 1. 1)兔及鼠抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG的制备
[002引 1. 1. 1)重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的制备、纯化：
[002引 1. 1. 1. 1)对人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白进行生物信息学分析，分别获 取人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肤段，找到其 对应的基因序列；
[0027] 1. 1. 1. 2)在步骤1. 1. 1. 1)中所得到的基因序列的5'端及3'端分别引入酶切位 点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为PspAl、PspA2 ;其序列参见序列表；
[0028] 1. 1. 1. 3)将步骤1. 1. 1. 2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物学方法分别克隆 入表达载体祀T-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述 重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均W可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；
[0029] 1. 1. 1. 4)用媒柱纯化步骤1. 1. 1. 3)所得到的重组PspAl-His、PspA2-His融合 蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，再W化a壯ord法测定蛋白质浓度，调整二种蛋白浓度均为 0.2mg/mL后备用；
[0030] 1. 1. 2)兔及鼠抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[003U 1. 1. 2. 1)W步骤1. 1. 1. 4)中所得到的重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白为完 全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋 白抗血清及鼠抗重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组PspAl-His、 PspA2-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于IX 105 ;
[0032] 1. 1. 2. 2)采用用Protein G亲和层析柱分别纯化兔抗重组PspAl-His、PspA2-His 融合蛋白抗血清及鼠抗重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG ;
[0033] 1. 1. 2. 3)用凯基化aford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1. 1. 2. 2)所得到的四种 多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为Img/mL后备用，此四种多克隆抗体IgG即 分别为兔抗人肺炎链球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体Ig