基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针及其系统和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学光学荧光技术，具体涉及一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针及其系统和方法。
【背景技术】
[0002]分子医学影像是采用高特异性的探针，无创地与体内细胞特定的靶位点结合，以影像方式反映分子水平的生理和病理信息。由于分子影像是在细胞和分子水平对疾病进行研究，所以分子医学影像具有高灵敏度和高特异性。能和靶位点特异性结合的物质(如配体或抗体等)与能产生影像学信号的物质(如同位素、荧光分子或顺磁性原子)以特定方法相结合而构成的一种复合物，即为分子探针。作为分子医学影像中的关键技术，分子探针的制备水平将影响整个系统的成像质量。按照临床诊断或基础研究的需要，可以选用不同的分子生物学载体设计符合分子影像学要求的探针，以完成特异性诊断或研究的任务。在生物医学荧光成像技术中，常采用荧光分子或荧光蛋白作为信号分子，通过检测激发的荧光信号来定位探针。
[0003]在传统的多荧光标记染色当中，首先需要找到合适的发射谱互相不重叠的多种荧光分子，方能通过滤光片实现对不同波段荧光的分离观测；其次，选中的所有荧光分子还需要与其它分子具有较好的绑定性能，能够结合共同组成分子探针，对多荧光标记而言在荧光分子的选择上本身就有一定的难度。此外探测每一种荧光分子需要对应完整的从激发光源、滤光片到二向色镜等一套光路必需元件，硬件成本较高。在实际操作中由于荧光分子发射谱之间的不完全分离以及存在广泛的背景荧光干扰等原因，造成对某种波长荧光观测时混入其它荧光信号，降低观测信噪比，影响观测结果。
【发明内容】
[0004]为了克服以上现有技术中存在的问题，本发明提出一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针及其探测系统和探测方法。
[0005]本发明的一个目的在于提供一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针。
[0006]本发明的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针包括:纳米粒子、荧光分子和靶向性分子；其中，荧光分子为对温度敏感的小分子荧光分子；荧光分子与已知吸收谱的纳米粒子之间直接连接或者间接连接；纳米粒子再与革E1向性分子直接或间接连接；IE向性分子通过特异性结合作用结合到靶位点。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针系统。
[0008]本发明的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针系统包括:纳米粒子、荧光分子、靶向性分子、激发光、加热源和荧光探测器；其中，荧光分子为对温度敏感的小分子荧光分子；荧光分子与已知吸收谱的纳米粒子之间直接连接或者间接连接；纳米粒子再与靶向性分子直接或间接连接；荧光分子、纳米粒子和靶向性分子构成分子探针；当分子探针分布在成像区域内，靶向性分子通过特异性结合作用结合到靶位点；激发光入射到成像区域，激发荧光分子发出荧光；荧光探测器检测荧光；加热源入射至成像区域，对纳米粒子加热，改变纳米粒子的温度，同时改变纳米粒子周围微环境温度，从而影响与纳米粒子连接的荧光分子的发光特性，荧光强度或者光谱发生改变，实现光调控。
[0009]本发明的又一个目的在于提供一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针的探测方法。
[0010]本发明的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针的探测方法，包括以下步骤:
[0011]1)将选定的对温度敏感的小分子荧光分子与已知吸收谱的纳米粒子之间通过共价键直接连接或者通过连接分子间接连接，纳米粒子再连接靶向性分子，荧光分子、纳米粒子和革E1向性分子构成分子探针；
[0012]2)当分子探针分布在成像区域内，靶向性分子通过特异性结合作用结合到靶位占.
[0013]3)激发光入射到成像区域，激发荧光分子发出荧光；
[0014]4)加热源入射至成像区域，对纳米粒子加热，改变纳米粒子的温度，同时改变纳米粒子周围微环境温度，从而影响与纳米粒子连接的荧光分子的发光特性，荧光强度或者光谱发生改变；
[0015]5)撤去加热源，在微纳米尺度上热量扩散速率快，纳米粒子的温度迅速降低，从而实现即时的光调控。
[0016]其中，在步骤1)中，对于待探测的靶位点，选择能与其结合且仅与其结合的靶向性分子。荧光分子与纳米粒子之间的连接，采用纳米粒子表面本身带有的基团与荧光分子的活化基团形成共价键，从而将焚光分子直接连接在纳米粒子的表面；纳米粒子的基团为羟基、羧基和巯基中的一种，形成的共价键为酰胺键、酯键、二硫键和醚键中的一种。若荧光分子与纳米粒子发生易于能量传递和相互作用的情况下，则通过线性或枝化的有机小分子、高分子聚合物或生物分子作为连接分子，连接分子的一端与纳米粒子相连，另一端与荧光分子的分子相连，从而将焚光分子的分子固定在纳米粒子周围但不发生直接接触，形成间接连接。或者，荧光分子与纳米粒子之间通过包覆层进行间接连接。同样地，靶向性分子通过共价键连接到纳米粒子的表面；或者通过线性或枝化的寡聚物到高聚物作为连接分子，间接连接至纳米粒子的表面；或者革E向性分子通过包覆层与纳米粒子进行间接连接。
[0017]在步骤2)中，分子探针分布在成像区域分为三种方式:a)将结合有分子探针的靶位点组织制作成显微切片，在荧光显微镜下观察；b)若用于活体影像，则需要通过系统给药或局部给药的方法将分子探针注射或注入到体内；c)若用于术中检查，则需要在术中将分子探针注射、涂抹或涂敷在成像区域内。
[0018]在步骤4)中，加热源采用调控光、微波或者超声中的一种。若采用调控光作为加热源对纳米粒子加热使其升温，则纳米粒子的吸收峰应避开作为荧光分子的激发光的波长，避免产生交叉影响，以保证在激发光入射时，只有荧光分子受激发出荧光。
[0019]进一步包括通过提取调控的荧光信号去除背景荧光，具体包括以下步骤:a)打开激发光光路，荧光分子被激发，荧光探测器对成像区域进行成像，得到调控前图像；b)打开加热源，对成像区域进行加热，荧光强度发生改变，荧光探测器再次对成像区域进行成像，得到调控后图像；c)将调控前后的图像进行相减或滤波处理，从而去除大部分背景荧光，实现去除噪声和背景信号的目的。
[0020]对于多个不同的靶位点，分别选择与其相对应的靶向性分子，并将不同的靶向性分子一一对应地分别连接至不同的纳米粒子，不同的纳米粒子具有不同的吸收峰；当加热源为调控光时，对于不同波长的调控光，与其对应的纳米粒子升温，调控与纳米粒子相连的荧光分子的强度或光谱，从而对于同一种荧光分子，同一种激发光，采用不同的纳米粒子调控，分别对应标记不同的靶位点，即能够实现同一种荧光分子、同一条荧光光路下，利用不同吸收峰对应的外加调控光调控各靶位点的荧光强度，实现对多位点荧光标记的观测和成像。在现有荧光成像技术中，如需要进行多种荧光标记，需要寻找合适的谱之间重叠较少的多种材料，并且每一种荧光需要与对应的激发调控光、滤光片、二向色镜等相配套使用。
[0021]另一方面，对于每一种荧光分子、纳米粒子和靶向性分子构成分子探针，通过对荧光强度改变前后的图片进行相减对比处理，可轻松实现对该分子探针的精确标记定位，特异性好，并且由于背景荧光不受外加热源调控，将大大减少背景荧光干扰，提高信噪比，提升空间分辨率，具有可观的应用前景。
[0022]本发明的优点:
[0023]本发明通过对纳米粒子微环境温度控制的方法间接调控与纳米粒子绑定的荧光分子发光，实现了一种不改变激发光的分子探针即时调控方法，操作简单易行；本发明对同一种荧光分子采用吸收峰不同的纳米粒子进行调控，分别对应标记不同的靶位点，即可实现在同一种荧光分子、同一条荧光光路下，利用不同吸收峰对应的外加调控光调控各自位置的焚光强度，实现对多位点焚光标记的观测和成像；对于每一种焚光分子、纳米粒子和革巴向性分子构成分子探针，通过对荧光强度改变前后的图片进行对比，可轻松实现对该分子探针的精确标记定位，特异性好，并且由于背景荧光不受外加加热源调控，将大大减少背景荧光干扰，提高信噪比，提升空间分辨率，具有可观的应用前景。
[0024]本发明也可以应用于活体荧光成像。通过系统给药或局部给药的方法将分子探针注射或注入到体内，在成像系统中观测浅层皮下的探针标记情况，并通过外加调控光对不同种荧光分子进行调控，具体方法及原理如上述，对结果图片进行处理分析，可以得到较为精确的活体荧光成像结果。
【附图说明】
[0025]图1为本发明的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针系统的一个实施例的示意图；
[0026]图2为本发明的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针的一个实施例的示意图；
[0027]图3(a)?(f)分别为本发明的的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针的不同连接方式的示意图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图，通过实施例对本发明做进一步说明。
[0029]如图1所示，本发明的基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针系统包括:纳米粒子11、荧光分子12、靶向性分子13、激发光2、加热源3和荧光探测器4 ;其中，荧光分子、纳米粒子和靶向性分子构成分子探针；将分子探针注入至成像区域5 ;激发光2入射到成像区域，激发荧光分子发出荧光；荧光探测器4检测荧光；加热源3入射至成像区域5，改变纳米粒子周围微环境温度，从而影响与纳米粒子连接的荧光分子的发光特性，荧光强度或者光谱发生改变，实现光调控。对温度敏感的荧光分子是指