一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于适配体的农药残留快速检测方法，属于农产品安全检测技术领域。
【背景技术】
[0002]农药对农业保持丰收增产起到了很大的作用，其已成为一种重要的生产资料，现在生产领域中应用的种类已经达到100多种，被用于防治病、虫、杂草对农作物危害，对促进农业增产有着重要的作用。但是，农药的不合理使用，不仅造成了水环境、土壤、大气的污染，也导致了农产品中农药残留超标，引起人体中毒以及贸易壁皇。随着人们生活水平的提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其果品、蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。毒死蜱是目前全世界生产和销售量最大的杀虫剂品种之一。毒死蜱是高效中毒的广谱杀虫剂兼除草剂，具有一定的内吸性，可以通过食物链的富集作用转移至人体，对人体具有潜在致癌作用，因此，毒死蜱一直是环境和食品中农药残留检测的重要项目。加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境以及保障人类健康有着十分深远的意义。
[0003]核酸适配体(Aptamer，又称适配体、适配子)是人工合成的核酸序列，经多次筛选获得的适配体与靶标分子有很高的特异性和亲和力。适配体的识别特性与抗体相似，又称“化学抗体”。与抗体相比，适配体是由体外筛选和扩增获得，不需要免疫动物或培养细胞，具有极好的准确性和重复性，很高的纯度，可以避免产生批间差异等优势。另外，核酸适配体无免疫原性，可在不同温度、不同离子浓度、金属螯合剂存在条件下反复变性和复性，在合成过程中，各种报告分子(荧光素或生物素)和功能集团可精确地结合在适配体位点上。目前用抗体进行检测和诊断的技术几乎可以全部由适配体来代替。因此本文尝试制备一种检测毒死蜱残留的适配体传感器。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种基于上述优点以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测毒死蜱农药残留的适配体传感器制备方法。采取的技术方案为:
一种检测毒死蜱残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于，是在经过清洗、活化和性能测试的裸玻碳电极表面滴涂介孔碳-壳聚糖复合液，然后用二茂铁-多壁碳纳米管进行修饰，再在修饰后的电极上固定毒死蜱适配体，最后用牛血清蛋白封闭，得到检测毒死蜱的适配体传感器。
[0005]所述方法的步骤如下:
1)清洗、活化并测试裸玻碳电极，获得预处理玻碳电极；
2)制备介孔碳-壳聚糖复合液；
3)将步骤2)制备的介孔碳-壳聚糖复合液滴涂到步骤1)的预处理玻碳电极上，分散均匀后，利用二茂铁-多壁碳纳米管进行修饰，得到修饰电极；
4)在步骤3)所得的修饰电极上固定毒死蜱的适配体，获得固定电极； 5)用牛血清蛋白封闭步骤4)所得的固定电极，得到毒死蜱适配体传感器。
[0006]所述方法步骤1)所述清洗、活化并测试裸玻碳电极是利用热piranha溶液浸泡裸玻碳电极后，用A1203浆抛光，再依次用去离子水、ΗΝ03、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测裸电极循环伏安曲线峰电位差测试裸电极。
[0007]所述方法步骤2)所述制备介孔碳-壳聚糖复合液，是称取2 mg有序介孔碳溶于4 ml 0.2%壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声1小时，得到均一、浅黑色的悬浊液，得到介孔碳-壳聚糖复合液。
[0008]所述方法步骤3)所述在预处理电极表面上滴涂介孔碳-壳聚糖复合液，是取6yL分散均匀的介孔碳-壳聚糖复合液滴涂在电极表面，26°C下静置3h，然后用pH7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干。
[0009]所述方法步骤3)所述利用二茂铁-多壁碳纳米管进行修饰，是指取6 μ L 二茂铁-多壁碳复合物滴涂在电极上，26°C下静置2h，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干。
[0010]所述方法步骤4)所述固定毒死蜱的适配体，是将修饰电极沉浸在毒死蜱适配体溶液中，4° C条件下浸泡8 h，取出后用PBS缓冲液冲洗表面，晾干待用。
[0011]所述方法步骤5)所述用牛血清蛋白封闭固定电极，是指将固定电极浸入0.5%的BSA溶液中26 °C下静置2 ho
[0012]所述方法的具体步骤如下:
1)利用热piranha溶液浸泡裸玻碳电极后，用A1203浆抛光，再依次用去离子水、ΗΝ03、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测裸电极循环伏安曲线峰电位差测试裸电极，获得预处理电极；
2)制备介孔碳-壳聚糖复合液，是称取2mg有序介孔碳溶于4 ml 0.2%壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声1小时，得到均一、浅黑色的悬浊液，得到介孔碳-壳聚糖复合液；
3)在预处理电极表面上滴涂介孔碳-壳聚糖复合液，是取6yL分散均匀的介孔碳-壳聚糖复合液滴涂在电极表面，26°C下静置3h，然后用pH7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干，再取6yL 二茂铁-多壁碳复合物滴涂在电极上，26°C下静置2h，然后用PH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；
4)将步骤3)修饰所得电极沉浸在毒死蜱适配体溶液中，4°C条件下浸泡8 h，取出后用PBS缓冲液冲洗表面，晾干待用；
5)将步骤4)固定所得电极固定电极浸入0.5%的BSA溶液中26 °C下静置2 h。
[0013]所述一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备，其特征在于:适配体传感器的敏感界面组成包括介孔碳-壳聚糖复合物和二茂铁-多壁碳复合物，进而固定毒死蜱的适配体。
[0014]所述一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备，其特征在于:玻碳电极(d=3mm)的清洗，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征(制备介孔碳-壳聚糖复合物复合材料及二茂铁-多壁碳复合材料并以壳聚糖作为分散剂进行分散，利用介孔碳-壳聚糖及二茂铁-多壁碳的协同作用共同修饰电极)，适配体传感器工作曲线的建立，适配体传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。
[0015]所述一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备，其特征在于:实验条件的优化，主要包括适配体浓度、孵育时间；所制备的适配体传感器的工作曲线为A I =1.424 LgC (ng/mL)+24.18 (R2 = 0.996，1_105 ng/mL);适配体传感器性能检测包括特异性、重现性、稳定性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品回收率的测定。
[0016]其制备原理为:适配体传感器以核酸适配体生物分子作为识别元件，通过固定化技术将核酸分子结合到感受器表面，发生特异性识别反应后，生成的复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，再经过二次仪表放大并且输出信号，从而实现对待测物质的检测。本发明采用以壳聚糖作为分散剂制备的介孔碳-壳聚糖复合物和二茂铁-多壁碳纳米管对玻碳电极进行修饰。介孔碳具备大比表面积、均匀孔径分布、物理化学性能稳定的优点。二茂铁又名二环戊二烯合铁(Fc)，具有独特的夹心型结构，二价铁离子被夹在两个平面环之间互为交错构型。它具有亲油性、氧化还原可逆性、芳香性、低毒性、疏水性等特点，所以具有非常好的电化学活性和电催化功能。壳聚糖(CS)属于多糖类，它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。壳聚糖的良好成膜性为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了适配体的生物活性以用来和农药进行有效的特异性结合。此外，壁碳纳米管(MWCNTs)具有独特的结构和物理化学性质如低密度、高比模量、高强度、良好的电导性和温度传导性能，可促进电化学反应中电子的传递，进而增大适配体传感器的响应电流。采用本发明制成的适配体传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对农药残留量是否超标进行检测，避免因食用含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
[0017]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备，其特征在于:(1)适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在120 mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2)清洗好的裸玻碳电极表面滴涂分散均匀的介孔碳-壳聚糖复合物，继而修饰二茂铁-多壁碳纳米管复合材料，然后固定毒死蜱核酸适配体，最后用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点。适配体传感器制备结束后，放入冰箱里4°C保存备用。
[0018]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备，其特征在于:(1)将上述制备好的适配体传感器在工作底液中以不同的扫速做循环伏安方法扫描，可以得到峰值和扫速的关系，得到是受扩散控制的；(2)配置一系列的毒死蜱标准液，进行循环伏安扫描，得到抑制率，进一步得出上述制备的适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(3)配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备适配体传感器的选择性；(4)通过循环伏安扫描多段并且于冰箱中放置一段时间再次测量验证上述适配体传感器的稳定性，通过解离和再次检测其再生性能；(5)对实际果蔬样品进行分析得出该适配体传感器的回收率。
[0019]本发明制备的介孔碳-壳聚糖复合物，以具有良好生物相容性和成膜性的壳聚糖作为分散剂进行分散，得到的纳米复合物膜能够促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，用以制备响应信号强和灵敏度高的适配体传感器；具有大量氨基的纳米复合膜与二茂铁-多壁碳纳米管复合材料形成的体系具有较高的稳定性和高度有序性，增大适配体传感器的电流响应，并且改善电极表面的微环境，提高了传感器表面抗体的有效固定，从而增大了检测精度。
[0020]所述免疫传感器的制备工艺如下:(1)取6 μ L分散均匀的介孔碳-壳聚糖复合膜滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温下静置3 h，用ρΗ7.5的PBS冲洗电极表面；(2)电极表面晾干后，取6 μ L二茂铁-多壁碳纳米管复合材料滴涂在电极表面，常温下静置2 h，然后用PH7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；(3)将