利用液相色谱法评估霉菌毒素脱毒剂体外脱毒效果的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用液相色谱法评估霉菌毒素脱毒剂体外脱毒效果的方法。
【背景技术】
[0002]霉菌毒素(Mycotoxins)是霉菌在生长过程中产生的次级代谢产物，普遍存在于饲料原料和配合饲料中。
[0003]霉菌在生殖繁衍过程不但会消耗饲料的营养成分，降低饲料营养价值，而且还可能产生多种对动物有毒副作用的代谢产物，如:黄曲霉毒素(Aflatoxins)、赭曲霉毒素(Ochratoxin)、单端孢霉稀族毒素、伏马毒素(Fumonisin)和麦角(Ergot)等，引起动物采食量下降、饲料转化率降低、体质下降、发病率升高以及繁殖机能下降等。霉菌毒素具有广泛的致癌性(主要是肝脏和肾脏的癌变)、致突变、致畸性、生殖抑制以及免疫抑制等代谢干扰作用，在饲料一动物一畜产品一人的传递过程中不断浓缩，对畜牧生产、食品安全和人类的健康造成了严重的危害和巨大的经济损失。
[0004]防治霉菌毒素污染的最根本措施是预防霉菌毒素的产生。但谷物在田间生长及籽实收获的储藏和加工等各个阶段均可能感染霉菌，且谷物和饲料均是大宗产品，很难实现全过程温度和湿度等环境条件的严格控制。所以，霉菌及其毒素对谷物和饲料的污染几乎是不可避免的。据报道，全球超过25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素污染。我国近年的调查结果显不，我国伺料和原料霉囷毒素超标的比例尚达60%?70%以上。
[0005]降低饲料中霉菌毒素危害的方法主要有生物法(酶解和微生物发酵法等)、化学法(氢氧化钙、臭氧和氨破坏等)和物理法(清洗、热处理和吸附剂法等)，虽然这些方法均能不同程度地缓解霉菌毒素污染产生的毒副作用，但是在工业化生产中，添加霉菌毒素吸附剂是目前最直接、最具可操作性和可行性的方法。
[0006]霉菌毒素吸附剂在动物的消化道内吸附霉菌毒素，减少毒素进入动物体内的数量，从而保护动物免受霉菌毒素毒害。
[0007]自从20世纪60年代早期首次报道动物霉菌毒素中毒症以来，世界各地的研究者们在不懈地研究消除或降低其毒害的方法。但由于饲料中的霉菌毒素种类繁多，化学结构和性质各异，为防治带来巨大的困难。谷物生长、收获、运输、储存等过程均可能受到霉菌及其毒素的污染，防止霉菌繁衍、破坏已污染饲料中的毒素和降低其在消化道中的吸收量均是避免和缓解霉菌毒素对动物产生毒害作用的最有效方法。除防霉措施外，目前饲料工业中最经济可行的霉菌毒素脱毒方法是添加霉菌毒素吸附剂。
[0008]霉菌毒素吸附剂的选用应该注意以下几个问题，①针对性:明确哪些是目前饲料或食品原料中污染的主要霉菌毒素，有针对性地选用吸附剂产品。②广谱性:在该霉菌毒素吸附剂对毒性最大的黄曲霉毒素应有很强的吸附作用，并且能够吸附其他霉菌毒素(如呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等)。③专一性:该霉菌毒素吸附剂具有很好的选择性吸附作用，即对霉菌毒素有很好的吸附作用，并且不吸附维生素、微量元素等营养物质。④安全性:该霉菌毒素吸附剂不被动物吸收，在动物体内不残留对动物和人没有毒副作用。⑤可靠性:该霉菌毒素吸附剂的供应商和生产商能够提供包括实验室体外试验及动物体内试验在内的完整数据资料(最好是发表在世界上权威的学报刊物而非商业广告刊物)。⑥合法性:一定要通过动物试验自己进行效果验证。
[0009]在霉菌毒素研制过程中使用最多是简单的体外等温吸附法。该方法以水作为反应介质，根据吸附剂和毒素间的剂量反应关系，经分离固体吸附剂后，测定液相中剩余毒素的量，计算被吸收的量。常见指标有单浓度吸附率、等温吸附曲线和化学吸附常数(Ca)。该法在固定pH值和单一水介质中反应，不能反映消化道的复杂成分环境及pH值变化。有的研究虽模拟了消化道生理环境，但未考虑胃肠道pH变化和食糜滞留时间，以及消化酶对吸附效果测值的干扰。Ruby在研究污泥中金属元素的生物利用率时，考虑了单胃动物酶、盐、PH、温度和时间间隔之间互作的影响，所用的胃肠道模型都是人为添加各种物质，这与胃肠道环境相差甚远，所检测得到的结果也与吸附剂在体内真实情况有所差距。
[0010]目前生产中常用的毒素吸附剂种类繁多，质量参差不齐，也无统一的国家或行业标准，迫切需要建立可靠的霉菌毒素吸附剂吸附性能评估方法。
【发明内容】
[0011]本发明主要提供了一种利用液相色谱法评估霉菌毒素脱毒剂体外脱毒效果的方法，能够模拟胃肠道环境评价方法，用动物的消化道食糜上清液为反应介质，完全再现动物胃肠道环境，更加真实地评定吸附剂吸附效果。其技术方案如下:
[0012]—种利用液相色谱法评估霉菌毒素脱毒剂体外脱毒效果的方法，包括以下步骤:
[0013](1)前期准备
[0014]1.霉菌毒素标准曲线的绘制
[0015]a.称取霉菌毒素标准品配制成浓度为20 μ g/ml的霉菌毒素标准储备液；
[0016]b.称取霉菌毒素标准储备液分别配制成浓度为0 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml的霉菌毒素标准工作液；
[0017]c.向色谱柱注入霉菌毒素标准工作液，以标准工作液浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0018]I1.脱毒剂样品
[0019]称取待评估的脱毒剂过筛处理，得脱毒剂样品；
[0020]II1.反应介质的获取
[0021 ] 采集猪胃部或小肠肠道食糜，用离心机离心处理，提取上清液，保存备用；
[0022](2)脱毒处理
[0023]1.体外吸附脱毒评价
[0024]a.称取脱毒剂样品，用双蒸水配制成2mg/ml的脱毒剂溶液，避光搅拌处理；
[0025]b.吸取等量的脱毒剂溶液和lOyg/ml的霉菌毒素标准工作液至离心管中，恒温振荡避光吸附脱毒；
[0026]c.离心处理，得上清液一；
[0027]II模拟体内吸附脱毒评价
[0028]a.称取脱毒剂样品，溶于反应介质和双蒸水的混合液中，脱毒剂的浓度为2mg/ml，反应介质的体积含量为10%，避光搅拌处理；
[0029]b.吸取等量的脱毒剂溶液和lOyg/ml的霉菌毒素标准工作液至离心管中，恒温振荡避光吸附脱毒；
[0030]c.离心处理，得上清液二；
[0031](3)液相色谱检测
[0032]取上清液一和上清液二分别进行HPLC检测。
[0033]优选的，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮或呕吐毒素。
[0034]优选的，所述液相色谱检测的条件为:
[0035]色谱柱:C18柱，长150mm，内径4.6mm,填料直径5 μ m ;
[0036]流动相:对黄曲霉毒素测定时，流动相体积比为甲醇:水=48:52，超声脱气，经过0.45 μ m滤膜过滤；对玉米赤霉稀炯测定时，流动相体积比为乙腈:水=1:1，超声脱气，经过0.45 μπι滤膜过滤；对呕吐毒素测定时，流动相体积比为甲醇:水=20:80，超声脱气，经过0.45 μ m滤膜过滤；
[0037]流速:lml/min;
[0038]进样体积:20 yL;
[0039]检测波长:黄曲霉毒素:Ex = 360nm, Em = 440nm ;玉米赤霉稀酮:Ex = 274nm，Em=440nm ;呕吐毒素:218nm ；
[0040]保留时间:10min。
[0041]优选的，步骤(1)前期准备中，脱毒剂样品为过0.28_孔筛。
[0042]优选的，步骤⑴前期准备中，采集猪小肠肠道食糜为用离心机20000rpm离心处理。
[0043]优选的，步骤(2)脱毒处理中，吸取0.25ml脱毒剂溶液和0.25ml的10 μ g/ml的霉菌毒素标准工作液至1.5ml离心管中，37°C恒温振荡避光吸附脱毒4小时。
[0044]优选的，脱毒剂对霉菌毒素的吸附率按式(A)计算:X = ml/m0*100%= (m0-m2) /m0*100%式(A)，其中，X为吸附率，mO为霉菌毒素的添加量，ml为霉菌毒素的吸附量，m2为霉菌毒素的残余量。
[0045]采用上述利用液相色谱法评估霉菌毒素脱毒剂体外脱毒效果的方法，本发明具有以下优点:
[0046](1)本发明提供了霉菌毒素脱毒剂对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的体夕卜、体内模拟的评估方法，适用于不同脱毒剂产品对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的吸附率评估；
[0047](2)本发明选用成年健康猪胃和小肠食糜上清液作为体外评价试验的反应介质，该介质应含有动物消化道可能干扰霉菌毒素吸附的各种化学成分和酸碱环境，同时模拟动物消化道的温度和运动条件，旨在使评价结果更加接近吸附剂在体内作用效果；
[0048](3)本发明的评估方法可以用于筛选合适的脱毒剂，在筛选脱毒剂时，首选是进行体外吸附脱毒评价，以水为反应介质，初步筛选有效的霉菌毒素脱毒剂；二是模拟胃肠道环境评价方法，用动物的消化道食糜上清液为反应介质，完全再现动物胃肠道环境，更加真实地评定脱毒剂吸附脱毒效果。
【具体实施方式】
[0049]—、试剂与溶液
[0050]除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T 6682中的一级用水规定。
[0051]1.试剂
[0052]甲醇(色谱纯)
[0053]超纯水(去离子水)
[0054]乙腈(色谱纯)
[0055]乙腈-水混合液:50ml乙腈与50ml超纯水混合
[0056]黄曲霉毒素B1标准品:纯度会99% ;玉米赤霉烯酮标准品:纯度会98% ;呕吐毒素标准品:纯度会98%。
[0057]2.霉菌毒素