一种用于赭曲霉毒素a富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及赭曲霉毒素 A样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于赭曲霉毒 素 A富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副 广品后所广生的有毒代谢广物。赫曲霉毒素 A是赫曲霉毒素中毒性最强、广量最尚的一种， 对人和动物有强烈的毒害作用，可以导致动物的肾萎缩、胎儿畸形、流产、死亡，并且具有高 度的致癌性。赭曲霉毒素 A在大麦、小麦、燕麦、玉米等大多数谷物中存在。用受赭曲霉毒 素 A污染的谷物饲养的家禽也会受到污染，赭曲霉毒素 A直接或间接危及人体健康。因此， 赭曲霉毒素 A是继黄曲霉毒素后又一个引起世界关注的毒素。1993年，国际癌症研究院 (The International Agency for Researchon Cancer)将赫曲霉毒素 A 定为 213组致癌物 质（可能是人类致癌物）。各国纷纷制定了谷物中赭曲霉毒素 A的限量标准，第56次FAO/ WHO食品添加剂联合专家委员会会议对赭曲霉毒素 A进行了危险性评价并制定了谷物食品 中赭曲霉毒素 A最大残留量标准为5 μ g/kg，我国和欧盟及其成员国也规定在谷物中最大 残留量为5 μ g/kg。
[0003] 目前食品中赭曲霉毒素 A的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法 等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、 所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从 而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害 试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高， 不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。
[0004] 免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年来发 展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB)既可结合活性蛋白 质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠 上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力 作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠 (Hffi)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学 和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显 著成绩。近年来以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等 标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。
[0005] 在分离真菌毒素方面，頂B可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避 免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。对目的毒素的富集具有高分离 率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优 点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化 的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团， 从而减少漏检，减少安全隐患。
[0006] 目前，虽有利用免疫磁珠富集分离黄曲霉毒素、T-2毒素的报道，但是免疫磁珠在 赭曲霉毒素 A上的应用却未见报道。本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集赭曲霉毒 素 A的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对赭曲霉毒素 A的富集能 力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及 饲料中赭曲霉毒素 A的分离与富集，可以进一步提高快速检测赭曲霉毒素 A的效率。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于赭曲霉毒素 A富集 净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决赭曲霉毒素 A样品净化分离操作复杂、分离 效率低、存在较大安全隐患的技术问题。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种用于赭曲霉毒素 A富 集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有赭曲霉毒素 A单克隆抗体；所述赭曲霉毒素 A单 克隆抗体是用赭曲霉毒素 A人工抗原免疫白鼠所得到的；所述赭曲霉毒素 A人工抗原是赭 曲霉毒素 A半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式I所示：
[0010] 所述赭曲霉毒素 A人工抗原是按照如下方法制备得到的：
[0011] 18mg赭曲霉毒素 A半抗原溶于ImL N, N-二甲基甲酰胺（DMF)中，50mg载体蛋白 溶于3. 75mL0. lmol/L的CB缓冲液（pH 9.6)中，将半抗原溶液加入到蛋白溶液中，4°C搅拌 反应24h ;再加入0. 25mL lmol/L的赖氨酸溶液（pH7. 0)，4°C反应2h，将得到的产物透析， 得到所述赭曲霉毒素 A人工抗原。
[0012] 所述赭曲霉毒素 A半抗原的分子结构式如式II所示：
[0014] 所述赭曲霉毒素 A半抗原是按照如下方法制备得到的：I、将IOOmg赭曲霉毒素 A溶于5mL丙酮中，再加入50 μ L 3-溴丙缩醛和40mg碳酸钾，回流反应5h，停止反应，加 水-乙酸乙酯萃取，分去水相，加无水硫酸钠干燥蒸干，得到粗产物，加石油醚洗涤结晶，得 到中间产物；II、将中间产物加乙醇溶解后，再加入2mL稀盐酸和5mL蒸馏水，60°C反应4h， 停止反应，加氢氧化钠水溶液调节pH到6,加二氯甲烷萃取，蒸干，加乙醚重结晶，得到赭曲 霉毒素 A半抗原。
[0015] 本发明还提供了一种上述免疫磁珠的制备方法，是以粒径2. 8 μπι的羧基磁珠为 载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂H)C-NHS组合处理后，活化磁珠 可与赭曲霉毒素 A单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化赭曲霉毒素 A的免疫磁珠；
[0016] 上述免疫磁珠的制备方法具体描述如下：
[0017] (1)清洗：取IOOyL羧基磁珠于离心管中，用IOOyL含0.05%吐温-20的PH5.0、 25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
[0018] (2)活化：用 4°C贮存的 pH5. 0、25mmol/L MES 溶液分别配制 50mmol/L 的 EDC、NHS 溶液；分别加入50 μ L新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混勾，室温活 化30min，磁分离后移除上清，同（I)MES溶液洗涤2-3次；
[0019] (3)偶联：将赭曲霉毒素 A单克隆抗体溶解到60 yL pH5. 0、25mmol/L MES溶液中， 用所述MES溶液调节总体积至100 μ L，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4°C偶 联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
[0020] ⑷封闭：磁分离后移除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的TRIS溶液反应15min封闭磁 珠；
[0021] (5)保存：磁分离后移除上清，用IOOyL含0. 1 %-0.3 %牛血清白蛋白（BSA)、 0. 1 %吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含 0· 1% -0· 5% BSA、0. 01% -0· 1%吐温-20、0· 02% NaN3的 TRIS 溶液中，2-8°C保存备用。
[0022] 本发明同时提供了上述免疫磁珠在富集净化赭曲霉毒素 A中的应用。
[0023] 实验证明，本发明用于赭曲霉毒素 A富集净化的免疫磁珠对赭曲霉毒素 A有很高 的富集率和回收率，对赭曲霉毒素 A的富集率为20ng/mg (每毫克免疫磁珠可以捕获20ng 赭曲霉毒素 A)，对赭曲霉毒素 A的回收率达到85%以上。本发明用于赭