基于荧光共振能量转移的双酚a痕量检测法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种荧光共振能量转移的双酚A痕量检测法。
【背景技术】
[0002]双酚A，也称BPA，在工业上被广泛用于聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料的合成。60年代以来就被用于制造塑料(奶)瓶、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层等。双酚A无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械及食品包装的内里，都有它的身影。然而研究表明PC材质的塑料在高温下易水解，并且温度越高水解越快，水解生成的双酚A会污染被包装的食品，如果双酚A在体内长期积累则会导致免疫力下降等不良反应，尤其对婴幼儿的伤害更大。除此以外，国内外很多试验都证明双酚A是一种内分泌干扰素，低浓度长时间暴露的情况下，双酚A就可以对生殖系统、神经系统等有不良影响。
[0003]目前，双酚A的检测方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、荧光光度法、催化动力学分光光度法等，然而以上种种方法有着一些缺点，如检测仪器昂贵、稳定性不足、灵敏度不够高等，所以建立一套成熟的双酚A检测体系十分重要。
[0004]核酸适配子(Aptamer,简称适配子)是一段体外通过SELEX技术(配体指数富集的系统进化技术)筛选获得的寡核苷酸片段，可以是RNA或单链DNA。单链寡核苷酸的一些二级结构，如发夹、茎环等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为与靶标物质特定区域结合的基础。研究发现，凡是涉及抗体的应用领域，几乎都可以用寡核苷酸核酸适配体代替。与传统的抗体相比，适配体具有以下显著优点:亲和力高、特异性强、容易制备及修饰、稳定性好等。
【发明内容】
[0005]本发明就是针对上述问题，弥补现有技术的不足，提供了一种双酚A的优良性能，将双酚A适配子及其互补的短链DNA分别与荧光纳米材料和纳米金进行连接，通过两条单链DNA的碱基互补配对，两种材料结合在一起并发生荧光共振能量转移效应，纳米材料的荧光被纳米金所淬灭。
[0006]为实现上述目的，本发明的检测方法概述如下。
[0007]一种荧光共振能量转移的双酚A痕量检测法，包括如下步骤:
(1)称取 2.0 mmol KC1、1.0 mmol GdC13.χΗ20、0.1 mmol TbC13.6H20、1 mL 30% 聚丙烯亚胺(w/v)以及20 mL乙二醇,加入至100 mL圆底烧瓶中。充分搅拌至所有固体溶解。另取8 mmol NH4F加入至烧杯中，并加入20 mL乙二醇，放入40 V水浴锅中恒温搅拌至固体全部溶解。
[0008](2)将溶解的NH4F逐滴加入至圆底烧瓶中，充分搅拌1小时，形成悬浮80液。将悬浮液转入至高温反应釜中，放入电热鼓风干燥箱195 V恒温加热4小时。反应结束之后将产物分装入离心管中，10000 rpm离心15 min。弃去上清液，沉淀用乙醇以及超纯水超声清洗三次。最后成品烘干，研成粉末保存，即制得KGdF4:Tb3+纳米材料。
[0009](3)在三口圆底烧瓶中加入95.8 mL的超纯水(彡18.2 Μ Ω.cm)，再加入4.2 mL1% (w/v)氯金酸溶液，120 V搅拌加热，煮沸95回流10 min,然后迅速加入10 mL 1% (w/v)朽1檬酸三纳溶液，煮沸回流10 min。关闭热源，继续搅拌15 min,冷却至室温，即得纳米金胶体。产品至于棕色试剂瓶，置于4 V冰箱避光保存。
[0010](4)称取15 mg KGdF4:Tb3+荧光纳米材料加入至7 mL离心管中，加入5 mL PBS超声85分散20 min。之后加入1.25 mL 25% (w/v)戊二醛，放入至气浴恒温振荡器中，37 V恒温振荡2 h。取出后，用PBS超声清洗三次(9000 rpmUO min)。所得沉淀用0.9mL PBS重悬，加入0.1 mL (1 mg/mL)亲和素。37 V恒温振荡6 h。取出后用BB (25 mMTris-HClUOO mM NaCl、25 mM KC1、10 mM MgC12 和 5% DMSO、pH 8.0)清洗三次，加入 10UL (10 nM)生物素化的双酚A适配子，37 V恒温振荡2 h。取出后用BB清洗三次(9000rpm、90 10 min),再用BB配制成1 mg/mL的体系，构成基团A。放入4 V冰箱保存备用。
[0011](5)称取1 mL纳米金溶液加入至离心管中，10000 rpm离心15 min,弃去500yL上100清液。加入10 yL (50 nM)双酚A适配子互补链。放入气浴恒温振荡器中37V恒温振荡过夜。取出后加入5% (w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)，充分混匀。配制不同浓度的NaCl(0.1 M、0.5 M、1 M、2 M)，每次10 μ L从低浓度至高浓度逐滴滴入至纳米金中，每滴之间间隔1 h，至NaCl终浓度为0.31 M。37 V陈化过夜，构成基团B，放入4 V冰箱保存备用。
[0012](6)将上述制备的基团A (1 mL，lmg/mL)与基团B (用量为1.3.4所诉)混合在一起，充分振荡，放置于气浴恒温振荡器中37 V恒温孵育2 h。使用荧光光谱仪FLU0RMAX-4测定荧光光谱。激发波长250 nm，发射波长范围520至720 nm，主要发射峰位于543 nm处。
[0013](7)配制不同浓度的双酚A，在浓度范围0.1至150 ng/mL内取若干浓度值，分别为 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL>1 ng/mL>2 ng/mL>5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、150 ng/mL。将配制好的双酸A、基团A (1 mL, lmg/mL)与基团B (用量为1.3.4所诉)充分混合，37 V孵育2 h，双酚A与基团B竞争结合基团A，不同浓度的双酚A将影响基团A与基团B的结合量，从而导致荧光强度的变化。
[0014]本发明的有益效果:
本发明将双酚A适配子及其互补的短链DNA分别与荧光纳米材料和纳米金进行连接，通过两条单链DNA的碱基互补配对，两种材料结合在一起并发生荧光共振能量转移效应，纳米材料的荧光被纳米金所淬灭。当体系中加入双酚A时，双酚A将与互补DNA链竞争结合双酚A适配子，从而导致两种纳米材料结合量的不同，进而影响体系的荧光强度。
[0015]通过测定双酚A的浓度与体系荧光强度的线性关系，实现对双酚A的检测。在最优实验条件下，本法在双酚A浓度0.5~100 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，回归方程为Y=430.0Χ+75095 (R2=0.993)，检出限为0.16 ng/mL。并通过加标回收实验，证明本法可用于实际样品的检测。
【附图说明】
[0016]图1是实施例1的KGdF4:Tb3+纳米材料荧光发射图谱与纳米金紫外-可见吸收图谱的重叠(A)及KGdF4:Tb3+纳米材料的荧光淬灭(B)。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
一种荧光共振能量转移的双酚A痕量检测法，包括如下步骤:
(1)称取 2.0 mmol KC1、1.0 mmol GdC13.χΗ20、0.1 mmol TbC13.6H20、1 mL 30% 聚丙烯亚胺(w/v)以及20 mL乙二醇,加入至100 mL圆底烧瓶中。充分搅拌至所有固体溶解。另取8 mmol NH4F加入至烧杯中，并加入20 mL乙二醇，放入40 V水浴锅中恒温搅拌至固体全部溶解。
[0018](2)将溶解的NH4F逐滴加入至圆底烧瓶中，充分搅拌1小时，形成悬浮80液。将悬浮液转入至高温反应釜中，放入电热鼓风干燥箱195 V恒温加热4小时。反应结束之后将产物分装入离心管中，10000 rpm离心15 min。弃去上清液，沉淀用乙醇以及超纯水超声清洗三次。最后成品烘干，研