用于检测光度测定法的前带效应的方法

用于检测光度测定法的前带效应的方法
【专利说明】用于检测光度测定法的前带效应的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于通过光度、浊度或比浊免疫测定法组合判断是否存在前带效应来 测定样品中特定分析物的量的方法，其中所述特定分析物从所述分析物与分析物特异性测 定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量。
[0002] 均匀免疫测定法的特征在于无分离和洗涤步骤的程序。由于其简单的一步程序， 成本有效和速度均匀，免疫测定法在临床实验室中享受高的知名度，且通常用于高度自动 化的临床化学分析仪上的临床诊断。
[0003] 然而，均匀免疫测定法受高剂量Hook效应限制，所述Hook效应也被称为前带效 应或抗原过量效应，这是其中在高分析物浓度的测定响应降低且导致产生分析物的虚低测 量值的现象。该效应对于许多分析物已经报道且影响浊度和比浊测定法以及其它一步免 疫测定法，且由过高浓度的分析物引起，所述过高浓度的分析物饱和抗体的结合位点，因此 防止形成可检测的抗体-分析物-抗体复合物。以该方式，测定响应首先随着抗原浓度递 增而增加，然后在达到临界浓度值之后，测定响应降低，得到钟形曲线，所谓的海德堡曲线 (Heidelbergercurve)。测定法开发商和制造商通常尽一切努力来减少Hook效应，例如通 过增加抗体的量和通过减少分析所需的样品体积的量。总之，高剂量hook效应是一步免疫 测定法设计固有的现象；在使用洗涤步骤来消除抗原过量的两步测定形式中，高剂量hook 效应得到避免。还可以在使用非基于抗体的结合剂的其它一步结合测定法中观察到前带效 应。
[0004] 临床化学中使用的大多数现代自动分析仪已经安装了用于识别测量样品中的前 带效应的方法。在样品显示前带效应的情况下，所述分析仪标记样品测量。对于此类标记 的测量，根据仪器设置，所述分析仪推荐或甚至自动进行稀释之后样品的重新测量。
[0005] 本领域状态 存在几种用于判断样品中是否存在前带效应的方法： 样品稀释方法通过测试未稀释样品和稀释后样品来验证前带效应的存在。如果稀释后 的结果高于未稀释样品，则未稀释样品最可能表现出前带效应。不幸地，该方法增加劳动和 试剂成本。
[0006] 对于抗原再添加方法，将额外分析物在完成其测量之后添加至样品，且解读信号 中的额外变化。尽管该方法在检测前带效应中是准确的，但试剂成本由于抗原添加而增加。 此外，额外移取步骤增加分析仪上的工作流，因此导致通量降低。此外，抗原试剂占据分析 仪上的额外空间。
[0007] 动力学方法通过分析样品测量过程中获得的动力学数据来验证抗原过量的存在。 在大多数情况下，反应动力学取决于分析物浓度：低浓度样品可显示渐增信号，而高浓度样 品可显示在反应开始时的更快速信号增加和在反应结束时的低得多的信号增加。所述差异 可以用于识别前带效应的存在。
[0008] Rochecobasc分析仪上的应用的动力学方法也被称为反应速率方法。在这里， 比较最终试剂添加之后的两个不同时间的吸光度变化的速率（参见cobasc操作员手册； cobasc操作员手册训练）：表示为百分数的反应结束时的反应速率和反应开始时的反应 速率的比率被定义为前带检查值PC。对于各测定法，将表明前带效应的特定PC范围（定 义为下限和上限之间的范围）存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的PC值进行 自动比较（参见来自"cobasc311Analyzer-COBICD,CompendiumofBackground Information"的图2、3和4)。在前带效应存在的情况下，用〉Kin标记对于样品获得的结 果。
[0009] 任选地，至多两个不同限值（参见图4中的设置的第8个和第9个方框）可以在 Rochecobasc分析仪上定义且应用于各测量，所述测量决定在分析样品的前带检查值PC 之前如何进行。这些限值是信号的参考值，其通过计算特定时间段内的信号变化而在用于 分析物测定的波长处从样品获得。这些限值允许从前带检查忽略具有极低反应速率的样 品，且将此类样品直接分类为非Hook样品。cobasc分析仪中使用的动力学方法的缺点在 于，Hook样品和非Hook样品之间的差异并不总是最优的，因此当通过进行错误标记（例如 标记为"超出上限测量范围"，而不是"Hook样品"，或反之亦然）而将方法应用于来自相同 测定的不同批次时引起困难。
[0010] 该方法的一个进一步重要缺点在于其不适用于所有测定法，例如白蛋白测定法， 且在此类情况下，必须应用上述昂贵的抗原再添加方法，其通过额外移取步骤增加分析仪 上的工作流，因此导致通量降低。此外，抗原试剂占据分析仪上的额外空间。几种前带检测 方法使用简单的动力学数据分析式。应用此类方法的分析仪经常关闭，这是因为假前带报 警率高（Clin.Chem.Lab.Med. 1999)。
[0011] 在来自JP06213893的动力学方法中，任何测量点均用于前带检查。在JP 10282099中，通过比较测量时间内的两个测量部分彼此的测量数据而辨别前带效应的存在 或不存在。
[0012] 在JP63019560中，计算在波长λ?和λ2检测的吸光度值Α(λ1)和Α(λ2)之间 的比率，且与预设辨别水平进行比较，以检测前带效应。
[0013] JP04204378描述了计算在两种不同波长的吸光度差异ΛΑ(λ1)和ΛΑ(λ2)的比 率且将该值与预设参考值进行比较的前带检测方法。
[0014] 在JP05093725和JP06094717中，进行在2种不同波长的测量，随后通过使用线 性回归公式测定测量值和目标值之间的偏差比率。基于偏差进行前带效应的检测。
[0015] ΕΡ1845373涉及用于使用特定校准曲线测定样品中分析物与分析物结合物质的量 的方法，其中在不同的校准曲线测定前带阳性样品的分析物的量。
[0016] 上面提到的现有技术使用昂贵试剂，需要额外测量或复杂的信号评估程序。此外， 一些方法并不总是适用于所有测定法。
[0017] 待解决的问题 待解决的问题是提供用于前带检测的方法，所述方法是成本有效的（理想地无需消耗 任何试剂）、快速的（理想地通过与样品定量步骤同时进行的检测方法）、容易的、安全的 (理想地无假前带报警/少量假前带报警），且可以在自动实验室分析仪中实施。
[0018] 本发明的方法允许成本有效的方式，而无需消耗任何试剂。它是快速且容易的，因 为所述前带检测方法与样品定量步骤同时进行，并且它是安全的，因为它检测样品中是否 存在前带效应。此外，所述方法可以在自动实验室分析仪中实施。
[0019] 发明概述 本发明提供用于通过分析样品测量过程中获得的动力学数据来检测前带现象的改进 方法。从属权利要求中给出了本发明的实施方案。
[0020] 在第一个方面，本发明的方法用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品 中特定分析物的量，其中所述特定分析物从所述分析物与分析物特异性测定试剂相互作用 之后反应混合物的光信号变化来定量。
[0021] 在第一步骤中，对于待测定样品的特定分析物生成在至少一个波长和反应时间的 校准曲线，且将测量结果储存在仪器平台的数据管理系统中。
[0022] 对于待测定样品中的特定分析物，经完整反应时间，在用于测定分析物的波长和 至少在用于检测前带效应的额外特定波长，同时测量光信号。该额外波长不同于用于测定 分析物的波长。
[0023] 在下一步骤中，通过使用在用于检测前带效应的波长获得的信号来计算反应速率 比率R R=[时间段2时的反应速率/时间段1时的反应速率]X100,其中 时间段2时的反应速率=[信号（时间点4)-信号（时间点3)] / [时间点4 -时间点3]且时间段1时的反应速率=[信号（时间点2)-信号（时间点1)] / [时间 点2 -时间点1]。
[0024] 通过计算比率值R与预定限值的比较，判断样品中是否存在前带效应。
[0025] 最后，通过在用于测定分析物的波长获得的光信号与校准曲线的比较来定量特定 分析物的量。
[0026] 本发明的一个实施方案是任选地可以定义其它限值且应用于各测量，所述测量决 定之前、即计算和基于反应速率比率R判断Hook效应的存在之前如何进行。这些限值是信 号的参考值，其在用于测定分析物的波长、和/或在用于检测前带效应的波长和/或其它波 长测量。此限值的一个实例可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于从前带检查忽 略具有极低反应速率的样品，且将此类样品直接分类为非Hook样品。此限值的一个进一步 实例可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于决定具有极高反应速率的样品是否被 立即分类为Hook样品或是否在计算反应速率比率R之后进行判断。
[0027] 在本发明的一个进一步方面，提供使用可商购的分光光度实验室测试法的仪器平 台，用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中特定分析物的量，其中所述仪器 平台的数据管理系统能够处理反应时间、校准点、校准模式、波长的数据，用于从一次样品 测量同时进行分析物测定和前带效应检测。
[0028] 本发明的另一个方面提供用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中 白蛋白的量的方法，其中根据本发明从特定分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后 反应混合物的光信号变化来定量所述分析物。
[0029] 发明详述 本发明提供用于通过分析样品测量过程中获得的动力学数据来检测前带现象的改进 方法。
[0030] 定义： 术语"分光光度测定法"，也称为"光度测定法"，是本领域众所周知的。光度测定法涵 盖浊度和比浊免疫测定法。在浊度和比浊免疫测定法中，特定分析物从基于所述特定分析 物和分析物特异性结合配偶体的凝集的反应混合物的浊度的变化来定量。
[0031] 术语"池度法（turbidimetry)和比池法（nephelometry) "是本领域已知用于基于 测量浊度对光的透射和散射的效果测定溶液中混浊的量或该浊度的方法。液体中的浊度是 由细分的悬浮颗粒的存在引起的。如果使光束通过混浊样品，则其强度由散射而降低，并且 散射光的量取决于颗粒的浓度、尺寸和尺寸分布。分光光度计测量增加的浊度（即，强度透 射光中光的减少），这是由于由免疫凝集反应导致的渐增的粒径引起的。这种增加的浊度是 由分析物引起的免疫凝集的直接量度，或由分析物引起的免疫凝集抑制的间接量度。在比 浊法中，测量散射光的强度，而在浊度法中，测量透射通过样品的光的强度。
[0032] 浊度测定法涉及测量当入射光束通过样品时入射光束的强度。光束可以通过悬浮 液或被颗粒吸收、反射或散射。作为结果，当光透射通过悬浮液时，光的强度降低。对于非 吸收性颗粒，由于散射引起的光强度的降低表示为浊度。
[0033] 比浊测定法是指当入射光束通过样品时，测量从入射光束以定义角度Θ散射的 光。在比浊法中，测量一段时间后的散射光的强度的变化，因为散射物质迅速增加尺寸。当 在固定的抗体-胶乳复合物存在的情况下测量时，散射光与初始抗原浓度成比例。进一步 的解释描述于J.A.Molina-Bolivar等人，JournalofMacromolecularScience,Part C-PolymerReview, 45:59-98, 2005〇
[0034] 本发明的免疫测定方法在有和没有微粒增强的情况下用所有已知凝集试验都起 作用。本发明中优选使用"微粒增强