基于amf为荧光素标记物的双酚a荧光偏振免疫分析检测方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种荧光偏振免疫分析检测方法，具体地说，是一种基于AMF为荧光素标记物的双酸A焚光偏振免疫分析检测方法；属于焚光偏振免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]双酚A (Bisphenol A, BPA),学名为2，2_ 二(4-羟基苯基)丙烷，是重要的有机化工原料之一，主要用于生产聚碳酸酯、不饱和聚酯树脂、环氧树脂聚苯醚树脂等高分子材料，适量添加双酚A能使塑料制品拥有轻巧、耐用等特性。因此，双酚A被广泛应用于饮料瓶、婴儿奶瓶、玩具、牙齿填充物等，在生产生活过程中双酚A在强酸、强碱或高温环境下，极易被释放出来进入水生环境中。研究发现垃圾堆中双酚A会从废弃塑料制品中释放出来，并随之进入生态环境中。人们可通过皮肤接触、呼吸道、消化道等途径摄入双酚A，双酚A在低剂量时即具有破坏人体内环境，对DNA以及肝肾细胞造成损伤，让人出现头昏、头痛、精神不安等身体不适。近年来，国内外非常重视对环境雌激素双酚A的检测，应用的较多为高效液相色谱法、荧光光度法、质谱联机法等仪器方法，仪器方法检测的灵敏度和精确性较好，但样品前处理过程复杂，且操作费时、分析成本高。目前，基于特异性抗原抗体结合的免疫分析方法成为研究的热点，因其具有操作简单快速、成本低廉同时具有较高的灵敏度，符合现场环境样本痕量监测的需要。荧光偏振免疫分析方法具有灵敏度高，适用范围广，不需样品前处理，快速得出分析结果等优点，适用于大量样本的快速筛选检测，目前没有基于双酚A单克隆抗体和4-胺甲基荧光素(AMF)为荧光素标记物的荧光偏振免疫分析方法的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种以4-胺甲基荧光素AMF与半抗原偶联制得的荧光标记物的双酚A荧光偏振免疫检测方法，该方法具有较好的特异性和灵敏度。
[0004]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的:
[0005]—种基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，该方法是利用双酚酸BVA作为半抗原偶联AMF荧光素合成得到荧光标记物，并以双酚A为标准品，用双酚A单克隆抗体作为抗体，建立双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法。
[0006]进一步的，上述的基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，该方法依次包括下述步骤:
[0007]I) AMF荧光素标记物的制备:
[0008]取双酚酸，N-羟基琥珀酰亚胺，二环己基碳二亚胺，溶解于N-N 二甲基甲酰胺中，室温避光搅拌过夜；
[0009]向以上反应液中加入AMF荧光素，室温避光搅拌反应3小时，制得BVA-AMF荧光标记物；
[0010]其中:双酚酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺与AMF荧光素质量比为:8-12: 9-12: 16-20: 0.8-1.2 ；
[0011 ] 2) AMF荧光标记物的纯化:
[0012]室温下进行薄层层析分离，分离纯化得到AMF荧光标记物，紫外透射仪下观察，选择二次分离纯化的Rf= 0.99的橙黄色条带，用甲醇洗脱萃取；
[0013]3) AMF荧光标记物工作浓度的确定
[0014]用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液稀释不同浓度的AMF标记物，取ImL稀释液放在试管中，充分混匀，用荧光偏振仪检测偏振光强度，以10倍空白溶液的偏振光强度作为其工作浓度，确定选取1: 12500稀释度作为工作浓度，空白溶液选用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液；
[0015]4)双酚A单克隆抗体工作浓度的确定
[0016]首先在每个试管中加入500 μ L I: 12500稀释度的AMF荧光标记物工作液，再分别于每个试管加入500 μ L不同稀释度的双酚A单克隆抗体稀释液，充分混匀，室温下孵育lOmin，用荧光偏振仪检测偏振光强度值，确定选取1:200稀释度作为抗体的工作浓度；
[0017]5)竞争试验
[0018]双酚A 用 10% PBS 缓冲液稀释成 0、3、10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL 系列浓度，分别加入不同的试管中，每管20 μ L，然后向每管加入500 μ L稀释度为1:12500的AMF荧光标记物工作液，最后向每管分别加入500 μ L稀释为1:200的双酚A单克隆抗体工作液，充分混匀，于室温孵育lOmin，用荧光偏振仪检测偏振光强度值；
[0019]6)双酚A标准抑制曲线的绘制:
[0020]以抑制率mP/mPo为纵坐标，以双酚A浓度对数值为横坐标，作图建立双酚A的标准抑制对数曲线；
[0021]7)实际样品的检测:
[0022]以实际样品按照步骤5)的方法进行检测，测得的偏振光强度值为双酚A的标准抑制对数曲线对照，确定样品的双酚A残留量。
[0023]更进一步的，上述的基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，所述薄层层析分离时的展开液为体积比4:1:0.1的CHC13-CH30H-CH3C00H。
[0024]与现有的技术相比较，本发明提供的技术方案中AMF具有快速偶联半抗原，且荧光素不需要改性，本身含有的氨基具有与半抗原上已活化的羧基结合的能力，反应快速而有效。偶联得到的荧光标记物与抗体结合能力更强，具有较高的荧光信号，比普通的FITC衍生物偶联制备的BVA-EDF和BVA-1ysFITC的荧光信号更强。
【附图说明】
[0025]图1是不同荧光标记物与双酚A单克隆抗体结合的能力；
[0026]图2是荧光偏振免疫分析法检测双酚A标准工作曲线；
[0027]图3是荧光偏振免疫分析法检测双酚A竞争抑制曲线；
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的权利要求做进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求范围内。
[0029]实施例1
[0030]1、AMF荧光素标记物的制备
[0031]称量10.9mg双酚酸，10.4mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，18mg二环己基碳二亚胺DCC，溶解于ImL的N-N 二甲基甲酰胺DMF中，室温避光搅拌过夜；
[0032]接着向以上反应液中加入Img AMF荧光素，室温搅拌反应3小时，制得BVA-AMF荧光标记物。
[0033]2、AMF荧光标记物的纯化:
[0034]以CHCl3 =