一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。
技术背景
[0002]抗生素是一种能抑制或杀死其他微生物细胞的生理活性物质，主要由微生物产生。自20世纪30年代发现青霉素以来，现如今已被发现的抗生素有2000多种。常在奶牛中使用的抗生素主要有氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类和大环内酯类等。其中，四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括四环素、金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素和二甲胺基四环素等。如果人类长期食用含抗生素残留的动物性食品后，药物不断在体内蓄积，会对人体产生毒性作用，增加细菌的耐药性，引起人体的过敏和变态反应，甚至会产生致癌、致畸、致突变作用。虽然近年来国际上严格限制抗生素的残留最大量，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象，因此实现对抗生素的检测是至关重要的。
[0003]普通电极上生物识别过程引起的阻抗变化非常小，微阵列电极则可以将反应过程中发生的阻抗变化放大，从而降低了检测时间，减少非目标分析物的干扰影响；传统电极表面的半无限线性扩散层易使反应物损耗，而微电极表面的球形扩散场能够加快反应物的供给速率；微电极能够加快反应物的供给速率，普通电极则易造成更大的反应物损耗。相比传统电极，微电极只需要较低浓度的电活性离子形成双层。所以，微电极能够在传统电极的灵敏度不足的低导电性的溶液中进行阻抗测试，同时，微阵列电极可实现传感器微型化，因此微电极与传统的检测系统相结合成为具有潜力的选择。传统的农药残留检测方法具有选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多种元素或化合物的优势，但其需要昂贵的仪器设备，样品的前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。因此本文尝试制备一种四环素残留的适配体传感器。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种能克服上述方法的缺陷，且灵敏度高、特异性高、集成化、便携化的四环素残留检测的适配体传感器检测方法。采用的技术方案为:利用微阵列电极的集成化、便携化，将纳米ΑΤ0-壳聚糖溶液滴在微电极工作区域，由于壳聚糖溶液良好的生物相容性，使四环素适配体稳定的固定在电极表面，从而使抗原抗体反应更有效，检测电极表面的阻抗值，研究该传感器的电化学性能。
[0005]所述方法的步骤如下:
1)首先对微阵列电极清洗，测试其阻抗值的变化；
2)将步骤1)所得微阵列电极进行底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数，进行优化，筛选出最佳的试验取值；
3)将步骤2)所得的微阵列电极，在最优条件下滴加纳米ΑΤ0-壳聚糖溶液，将其固定在电极表面，从而获得纳米ΑΤΟ-壳聚糖修饰界面；
4)在步骤3)所得纳米ΑΤΟ-壳聚糖修饰电极上滴加适配体，使其与纳米ΑΤΟ-壳聚糖自组装后获得适配体修饰界面；
5)利用抗原抗体间的特异性反应，滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测，建立不同四环素浓度与微阵列电极阻抗变化之间的关系曲线；
6)将牛奶样品液滴加在微阵列电极表面，加入底液PBS后进行阻抗检测，获得牛奶样品中是否含有四环素及是否超标的信息。
[0006]所述方法的步骤1)所述清洗并测试微阵列电极，是分别进入一定浓度的NaOH、HC1溶液中15min，再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。
[0007]所述方法的步骤2)所述底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数进行了优化:底液pH选取值为7.5 ;适配体浓度选取6 μΜ ;孵育时间30 min ;对不同条件下的阻抗值进行分析测试，确定微阵列电极测试过程中的最佳参数。
[0008]所述方法的步骤3)所述滴加纳米ΑΤ0-壳聚糖溶液，滴加量为3 μ L，固定30 min。
[0009]所述方法的步骤4)所述滴加不同浓度的四环素适配体溶液，滴加量为3 yL，固定40 min，孵育温度为室温。
[0010]所述方法的步骤5)所述滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测。
[0011]所述方法的步骤6)所述滴加不同浓度的四环素标准液，孵育30 min，滴加底液PBS后进行阻抗检测。
[0012]所述方法的具体步骤如下:
1)微阵列电极的清洗:首先在1M NaOH溶液中浸泡15min ;然后在1M HC1溶液中浸泡15 min ;再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。获得清洗干净的微阵列电极，便于在其表面进行修饰，保证构建传感器的准确性；
2)所述底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数进行了优化:底液pH很小时，测试阻抗值也很小，pH值增大的同时，阻抗值也在增加；当pH值在7.5时，阻抗值达到最大，继续增大pH值，其测试的阻抗值呈现出减小趋势，可能是由于在碱性或者酸性条件下，适配体的活性受到了影响，所以，本试验中选取7.5作为底液最佳pH值。将不同浓度的适配体分别固定到微阵列电极表面，修饰好的电极在与四环素结合反应前后进行阻抗分析，并对各浓度适配体的阻抗值变化进行比较:当适配体浓度从2μΜ增到6μΜ时，阻抗值不断增加，当适配体浓度进一步增大，其阻抗差也在增大，但几乎稳定不变，说明适配体在6 μ Μ浓度时，适配体在电极表面的固定量达到了饱和状态，所以，本实验最优适配体浓度为6 μ Μ。对于适配体和四环素孵育时间，对测试阻抗值的变化进行研究:随着时间的增加，阻抗差也不断增大，说明适配体传感器和目标检测物在发生结合反应，当孵育时间达到30min后，阻抗差值基本达到一个稳定的值，变化幅度很小，说明适配体与四环素的结合反应完成。因此，该实验选择四环素与适配体的最佳孵育时间为30min ;
3)取纳米ΑΤΟ-壳聚糖溶液，根据微阵列电极工作区域的大小，确定出试验所用最佳量，滴加纳米ΑΤΟ-壳聚糖溶液的量为3 μ?，固定30 min，从而获得ΑΤΟ-壳聚糖修饰的适配体传感器界面；
4)取四环素适配体原液，用PBS稀释不同倍数，配置2μΜ，4μΜ，5μΜ，6μΜ，8μΜ，10 μ Μ等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值为6 μ Μ，滴加四环素适配体的浓度为6μΜ，固定40min ;进而完成适配体在修饰界面的固定；
5)滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测，分析该适配体传感器对四环素的测试性能；
6)将牛奶样品液滴加在微阵列电极表面，加入底液PBS后进行阻抗检测，获得牛奶样品中是否含有四环素及是否超标的信息。
[0013]本方法的有益效果:
本发明对底液pH值、适配体浓度和孵育时间等参数进行了优化:7.5作为底液pH、6μΜ作为适配体浓度、30 min作为孵育时间。为进一步研究奠定了基础，且1-1.0X106 ng/mL范围内线性范围良好；
采用本发明制备的基于微阵列电极的四环素残留检测方法操作工艺简单，低电阻电压降，高分析效率，样品和试剂消耗量少，灵敏度高，特异性高，可实现样品检测的自动化。符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。
【附图说明】
[0014]图1纳米ΑΤ0-壳聚糖复合物的扫描电镜图
(a.低倍率下纳米ΑΤΟ-壳聚糖复合物的扫描电镜图；b.高倍率下纳米ΑΤΟ-壳聚糖复合物的扫描电镜图)
图2适配体传感器在不同浓度的四环素标准液:0.0到1.0Χ106 ng/mL范围内的Impensence 口向应曲线
(a.微阵列电极；b.纳米AT0-CS复合物修饰后的电极；c.固定适配体后的电极；d.孵育四环素后的电极)
图3适配体传感器影响参数的优化
(a.底液pH值的优化；b.适配体浓度的优化；c.孵育时间的优化)
图4适配体传感器对四环素检测的的标准曲线图5适配体传感器在实际样品检测中的加标回收率。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0016]实施例1 一种基于微阵列电极适配体传感器的制备步骤:
1)微阵列电极的清洗:首先在1M NaOH溶液中浸泡15min ;然后在1M HC1溶液中浸泡15 min ;再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗，如有需要，可以通过显微镜观察微阵列电极的表面状态，(清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法)；
2)纳米ΑΤ0-壳聚糖溶液的制备:取0.2 g壳聚糖粉末溶解于100 mL 0.2%乙酸溶液中并不断搅拌3 h，制备质量分数为0.2 %的壳聚糖溶液；然后用电子天平称量1.2 g纳米ΑΤΟ粉体溶于上述制备好的4mL壳聚糖溶液中，利用超声清洗仪超声30min，然后置于程式振荡器上，震荡30min，直到溶液达到均匀稳定的状态。图1为纳米ΑΤΟ-壳聚糖复