提高免疫检测准确性和线性范围的方法及试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及提高免疫分析仪检测准确性的方法和提高样本中分析物化学发光免 疫检测线性范围的方法及其所用试剂，所述方法和所述试剂均涉及生物素标记抗体，叮啶 酯或吖啶磺酰胺标记抗体，亲和素类物质固定的固相，清洗液和促发液，属于免疫技术领 域。
【背景技术】
[0002] 铁蛋白（ferritin)是一种水溶性的铁结合蛋白，存在于各种组织和体液中。它是 由24个蛋白亚基组成的球状蛋白复合体，也是细胞内主要的铁储存蛋白。当未结合铁原子 时，它被称作去铁铁蛋白（apoferritin)。每个铁蛋白一般可储存2500~3000个铁原子， 最多可达45000个铁原子。正常人血清中含有少量铁蛋白，但在妊娠期和急性贫血时，血清 中的铁蛋白浓度常常会降低，而在急慢性肝脏损害和肝癌等疾病时，血清中的铁蛋白浓度 常常会升高。血清中的铁蛋白含量变化可作为判断是否缺铁或铁负荷过量的指标。测量血 清中的铁蛋白浓度特别适合于区分由于体内铁利用不充足导致铁储存偏低引发的缺铁性 贫血。
[0003] 在人体中，铁蛋白以不同的分子形式存在，每种分子形式被称为异铁蛋白 (isoferritin)，这是因为铁蛋白的亚基以Η和L两种形式存在，不同铁蛋白中的Η亚基和L 亚基按不同的比例存在，但两个亚基的总数为24。酸性最强的异铁蛋白含有24个Η亚基， 而碱性最强的异铁蛋白含有24个L亚基。不同的异铁蛋白在不同的免疫检测中可能存在 不同的反应。
[0004] 糖类抗原CA19-9是胰腺癌、胃癌、结直肠癌和胆囊癌的相关标志物，大量研究证 明CA19-9浓度与这些肿瘤大小有关，是至今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。胰腺癌 患者85%~95%为阳性，CA19-9测定有助于胰腺癌的鉴别诊断和病情监测。当CA19-9小 于1000U/ml时，有一定的手术意义，肿瘤切除后CA19-9浓度会下降，如再上升，则可表示复 发。对胰腺癌转移的诊断也有较高的阳性率，当血清CA19-9水平高于10000U/ml时，几乎 均存在外周转移。胃癌、结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌的阳性率也会很高，若同时检测CEA 和AFP可进一步提高阳性检测率（对于胃癌，建议做CA72-4和CEA联合检测）。胃肠道和 肝的多种良性和炎症病变，如胰腺炎、轻微的胆汁郁积和黄疸，CA19-9浓度也可增高，其浓 度多低于120U/ml，必须加以鉴别。
[0005] 因人铁蛋白和CA19-9均为大分子蛋白，在采用诸如放射免疫分析法、酶联免疫吸 附测定法（ELISA)和免疫比浊法等之类的免疫分析法检测血清或血浆等样品中的铁蛋白 浓度时，多采用双抗体夹心免疫分析法进行检测。
[0006] 自从化学发光免疫分析法（chemiluminesent immunoassay, CLIA)于上个世纪 七八十年代问世以来，因其采用非放射性标记，且将抗原抗体免疫反应和化学发光信号相 结合，因而具有优良的特异性和显著提高的灵敏度，在国内外已得到广泛应用。目前，在市 场产品中主要利用的CLIA技术可分为三大类：（1)酶促化学发光免疫分析法，如中国专利 申请CN101545910A就采用这种方法，化学发光底物经酶的降解作用而发光，根据酶类型 不同，主要分为：a)辣根过氧化物酶（HRP)化学发光免疫分析法，其常用的化学发光底物 可选自鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物；b)碱性磷酸酶（ALP)化学发光免疫分析法，其常用 的化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物，常见的有AMPPD、CSPD、⑶P和⑶P-Star以及 Lumigen公司的PPD、Lumi-Phos和Lumi-Plus等；（2)电化学发光免疫分析法，如Roche公 司的Elecsys系列和Cobas系列电化学发光免疫分析系统就是米用这种方法，在电极表 面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程，其常 用的电子受体为三丙胺（TPA)，其常用的电化学发光试剂为三联吡啶钌；（3)基于吖啶酯 (acridinium ester)或卩丫啶横酰胺（acridinium sulfonylamide)的化学发光免疫分析 法，其化学发光试剂为吖啶酯或吖啶磺酰胺，不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件就能 发光。
[0007] 在上述三种CLIA技术中，酶促化学发光免疫分析法的主要缺点为工作曲线可能 随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移，因而灵敏度较低，此外酶的稳定性较差，活 性容易丧失，常需加大酶的用量，成本相对较高。而电化学发光免疫分析法测量准确度较 高，但其所涉及的电化学发光反应和发光信号检测是在专门配套的电化学发光免疫分析仪 的流动池中完成的，其仪器成本和售后维护费用高，测量方式复杂，不适合大规模推广使 用，而且在检测传染病类项目如乙肝五项、丙肝抗原和/或抗体、HIV抗体和/或抗原、梅毒 抗原和/或抗体、人单纯疱疹病毒I型/II型抗原和/或抗体、人巨细胞病毒抗原和/或抗 体、弓形虫抗原和/或抗体、风疹病毒抗原和/或抗体等时，由于流动池是重复利用的，即便 每次检测时利用清洗液多次清洗流动池，在先检测的强阳性样品仍然有可能少量地残留在 流动池中，这就会影响后续待测的阴性样品的检测结果，从而有可能导致假阳性结果出现。 而在第三种方法中，吖啶酯或吖啶磺酰胺与抗原或抗体的偶联相对简单，偶联物发光稳定， 发光量与吖啶酯或吖啶磺酰胺浓度呈线性关系，且发光为闪光型，发光快速集中且强度大， 便于快速检测，此外，发光反应干扰因素少，背景值低，信噪比高，因而越来越受到免疫诊断 试剂开发者的重视。
[0008] 比如，德国西门子ADVIA Centaur化学发光免疫分析仪检测铁蛋白时就是采用上 述第三种方法进行检测：往样品中加入吖啶酯标记的羊抗铁蛋白多克隆抗体和表面上偶联 着小鼠抗铁蛋白单克隆抗体的磁珠，进行清洗后，依次加入酸液和碱液，促发吖啶酯化学发 光，根据发光量确定血清或血浆样品中的铁蛋白浓度。此外，雅培公司的ARCHITECT铁蛋白 检测试剂盒也是利用铁蛋白抗体包被的磁珠和吖啶酯标记铁蛋白抗体检测血清或血浆样 品中的铁蛋白浓度。但是它们都未整合生物素-亲和素系统，其检测灵敏度仍待进一步提 高。罗氏公司的ElecsyslOlO/2010电化学发光免疫分析仪检测铁蛋白（或CA19-9)时，先 往血清或血浆样品中加入生物素标记抗铁蛋白（或CA19-9)单克隆抗体和三联吡啶钌标记 抗铁蛋白（或CA19-9)单克隆抗体，然后加入链霉素亲和素包被的磁性微粒，给电极施加电 压，检测电化学发光信号，虽然通过整合生物素-亲和素系统进一步提高化学发光信号，但 仍然存在电化学发光免疫分析法中所提及的缺陷。
[0009] 此外，美国专利US6986913B2实施例35揭示先将血浆与生物素标记羊抗PTH多克 隆抗体和吖啶酯标记羊抗PTH多克隆抗体孵育产生一种免疫复合物，然后加入链霉亲和素 包被的磁珠，通过生物素和链霉亲和素的相互作用，让这种免疫复合物结合到磁珠上，然后 利用清洗液进行清洗，经促发后，利用Liaison免疫分析仪检测化学发光信号。然而，利用 这种先加入生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体然后加入链霉亲和素包被的磁珠的方法检 测铁蛋白或CA19-9也有其不足之处：首先，利用这种方法检测不同浓度铁蛋白或CA19-9校 准品的发光量时，较高浓度的铁蛋白或CA19-9校准品产生的发光量很难有效地或更加有 效地区分开来；其次，在测量临床血清或血浆等样品时，这种方法的测量误差比较大，准确 性差；再者，这种方法的化学发光背景值偏高，会影响测量准确性。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术的不足之处，本发明发现在利用基于吖啶酯或吖啶磺酰胺的直接化 学发光免疫分析法检测样本时，先将样本与生物素标记抗体（Biotin-Ab)和亲和素类物质 固定的固相进行孵育，然后加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体（AE-Ab)再进行孵育，接着 利用清洗液进行多次清洗以便除去未结合的Biotin-Ab和AE-Ab，加入促发液并检测发光 值，可显著地增加检测不同浓度校准品时较高浓度校准品所产生的发光量相差幅度，并且 显著地降低化学发光背景值，同时提高临床血清或血浆等样品的检测准确性。所述样本选 自校准品、临床血清或血浆等样品。
[0011] 本发明中的"生物素标记抗体"中的抗体包括至少一种特异性结合样本中分析 物（记为A)的抗体，本发明中的"吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体"中的抗体包括至少一种 特异性结合样本中分析物A的抗体，所述分析物A可选自铁蛋白；肿瘤相关抗原，如AFP、 CEA、PSA、CA19-9、CA125、CA153、CA724 等；激素类抗原如 FSH、TSH、LH 等；传染病类抗原， 如HBsAg、HBcAg、HBeAg、HBxAg、HCV抗原等。对双抗体夹心免疫分析法而言，"生物素标记 抗体"中的至少一种特异性结合分析物A的抗体和"叮啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体"中的至 少一种特异性结合分析物A特异性结合分析物A的不同抗原决定簇。
[0012] 本发明所提及"样本的发光量"指的是在样本经与生物素标记抗体、亲和素类物质 固定的固相和吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体孵育后，形成"固相-生物素标记抗体-样本中 的分析物-吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体"复合物，除去未结合的生物素标记抗体和未结 合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，接着加入促发液后，化学发光信号产生，利用免疫分析 仪检测所述化学发光信号时所测量到的发光量。样本可以是分析物校准品，也可是临床血 清或血浆等样品，因此，本发明所提及"样本的发光量"与"分析物免疫分析发光量"的含义 相同。本发明中所提及的"校准品的发光量"是指当样本为分析物校准品时的"样本的发光 里ο
[0013] 本发明提供一种提高免疫分析仪检测准确性的方法，其步骤包括：（1)提供免疫 分析仪；（2)将样本与生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相孵育，形成反应混合液； (3)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，再进行孵育；(4)除去未结合 的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体；(5)加入促发液后，化学发 光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量。
[0014] 进一步地，所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中 的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
[0015] 进一步地，所述样本选自校准品、血清或血浆。
[0016] 进一步地，所述固相选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管或塑料珠。
[0017] 进一步地，所述生物素标记抗体的浓