胰岛素测定法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人胰岛素乳胶凝集免疫测定和测定试剂，利用所述测定和测定试剂可 以抑制血液样品测定中的非特异反应。
【背景技术】
[0002] 人胰岛素，一种分子量为5807的肽，是用于诊断和治疗糖尿病的重要分子标志物 之一。由于与浓度相关的原因，长期以来，竞争性RIA和化学发光免疫测定一直是用于人血 液样品中胰岛素测定的主流免疫测定技术。随着近来高灵敏度乳胶浊度免疫测定（LTIA) 的出现，已经报道了可用于生化自动分析仪的LTIA试剂，并且一些是可商购的。
[0003] 非专利文献1中描述的技术是使用固定有抗胰岛素抗体的乳胶颗粒的夹心LTIA。 然而，仅有少数夹心LTIA用于实际肽测定应用的事例，并且所述技术涉及需要解决的问 题。
[0004] 引用列表
[0005] 专利文献
[0006] PTL 1 :TO2011/010673
[0007] 非专利文献
[0008] NPL 1 :Kanto Kagaku Cias Insulin II Attachment (2010 年 2 月产生）
[0009] 发明概述
[0010] 技术问题
[0011] 本发明人通过使用基于利用非专利文献1的方法获得的测量值与相关领域的非 均质化学发光酶免疫测定（常规方法）中测量的值的偏差筛选的样品研究了抑制夹心LTIA 中非特异反应的方法，并且发现，当用含有两种以上特定pH缓冲剂的缓冲液进行LTIA免疫 反应时，可以减小与利用常规方法测量的值的偏差程度。基于该发现完成本发明。
[0012] 问题的解决方案
[0013] 具体地，本发明涉及以下各项。
[0014] [1]胰岛素测定法，所述测定法用于在含有两种以上具有pH缓冲作用的胺化合物 的缓冲液中利用固定有抗胰岛素抗体的颗粒进行免疫反应。
[0015] [2]根据[1]所述的测定法，其中所述具有pH缓冲作用的胺化合物选自由HEPES、 MES和Tris组成的组。
[0016] [3]根据[1]或[2]所述的测定法，其中所述缓冲液具有7. 3至7. 8的pH。
[0017] [4]在胰岛素的颗粒凝集免疫测定中抑制源自血液样品的非特异反应的方法，其 中所述方法包括在含有两种以上具有pH缓冲作用的胺化合物的缓冲液中利用固定有抗胰 岛素抗体的颗粒进行免疫反应。
[0018] 发明的有益效果
[0019] 本发明的测定法使得能够在血液样品测定中抑制非特异反应的同时进行人胰岛 素乳胶凝集免疫测定。配制用于免疫测定的pH缓冲剂以实现抗原-抗体反应中的最佳pH， 并且使用两种pH缓冲剂以加宽pH缓冲范围，或与主要pH缓冲剂组合以调节pH，已是普遍 的做法。然而，在缓冲液中含有两种以上特定pH缓冲剂将抑制非特异反应是全新的发现。
[0020] 附图简述
[0021] [图1]图1表示常规LTIA中获得的测量结果和本发明的测定法中获得的测 量结果的相关图，其中上图表示化学发光酶免疫测定（Lumipulse Presto" Insulin， Fujirebio)和常规LTIA(Cias Insulin II，Kanto Kagaku)之间的相关性，而下图表示化 学发光酶免疫测定（Lumipulse Pfesi〇K Insulin，Fujirebio)和本发明的测定法之间的相 关性。
[0022] 实施方案描述
[0023] 在本发明的测定法中用作分析物的血液样品是全血、血清或血浆。
[0024] 用于本发明的测定法的含有两种以上具有pH缓冲作用的胺化合物的缓冲液可以 选自由HEPES (2-[4-(2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸）、MES (2-吗啉乙磺酸）和Tris (三 (羟甲基）氨基甲烷）组成的组。缓冲液的浓度（当缓冲液含有两种以上具有pH缓冲作用的 胺化合物时，两种以上具有pH缓冲作用的胺化合物的总浓度）理想地是100mM至lOOOmM， 优选为200mM至800mM，更优选为400mM至800mM。缓冲液的优选的pH是7. 3至7. 8。
[0025] 可用于本发明的测定法的固定有抗胰岛素抗体的乳胶颗粒可以通过本领域已知 方法获得，所述方法包括专利文献1。
[0026] 用于实施本发明的试剂可以具有普通乳胶凝集免疫测定试剂的形式。例如，所述 试剂可以具有其中本发明的缓冲液被用作第一试剂，并且含有固定有抗胰岛素抗体的乳胶 颗粒的溶液被用作第二试剂的形式，或其中固定有抗胰岛素抗体的乳胶颗粒被包含在本发 明的缓冲液中的单一试剂的形式。
[0027] 用于实施本发明的试剂可以含有多种可以包含在乳胶凝集免疫测定试剂中的 已知组分，包括，例如，金属离子如钙离子和镁离子；离子、非离子和两性表面活性剂；螯 合剂如EDTA ;多糖和聚合物如硫酸葡聚糖；蛋白质如清蛋白；可商购的封闭剂如Hetero Block(0mega Biologicals，Inc.)、Block Ace(DS Pharma)和BPF(Toyobo);以及抗-IgM抗 体。
[0028] 本发明的测定法可以通过使用以下具体程序来进行。将血液样品加至在分析仪如 Hitachi 7170自动分析仪中的主要由pH缓冲液构成的第一试剂，并且在将所述样品孵育 后，将含有固定有抗胰岛素抗体的乳胶颗粒的第二试剂加至样品混合物。然后在适当的波 长，例如，在570nm的主波长和800nm的亚波长，测量样品的吸光度，以确定胰岛素浓度。
[0029] 本发明的测定法中具有pH缓冲作用的胺化合物的浓度是基于第一试剂与第二试 剂的体积混合比为3:1的情况。 实施例
[0030] 以下使用实施例更详细描述本发明。
[0031] [实施例1]
[0032] 1.测定程序
[0033] 在化学发光酶免疫测定（Lumipulse Prest〇l; Insulin，Fujirebio)，常规 LTIA(Cias Insulin II，Kanto Kagaku)，和本发明的测定法中，测量来自218位患者的血 清。
[0034] 利用专利文献1中描述的固定有抗胰岛素单克隆抗体的乳胶，使用如下制备的第 一试剂和第二试剂，来进行本发明的测定。
[0035] 第一试剂
[0036] 600mM MES
[0037] 200mM Tris
[0038] 200mM NaCl
[0039] 50 μg/mL Hetero Block(Omega Biologicals，Inc.)
[0040] 200 μ g/mL 抗-IgM 抗体
[0041] pH7. 5
[0042] 第二试剂
[0043] 7. 5mM Tris
[0044] 固定有66221抗体的乳胶
[0045] 固定有66226抗体的乳胶
[0046] ρΗ8· 0
[0047] 将血清（10 μ L)加入至在Hitachi 7170自动分析仪中的第一试剂（150 μ L)，并且 在将样品与第一试剂在37°C孵育5min后，将第二试剂（50 μ L)加入至混合物中。然后在 570nm的主波长和800nm的亚波长，在一定时程内的19至34个光度点处，测量样品的吸光 度，从而确定胰岛素浓度。
[0048] 2.测定结果
[0049] 在常规LTIA中测量的血清样品中，81个样品呈现超过在化学发光酶免疫测定 中被当作100的测量值±30%的测量值。另一方面，在本发明的测定中，没有血清超过 ± 30 %。通过在X轴上绘制来自化学发光酶免疫测定的测量值并且在Y轴上绘制来自常规 LTIA或来自本发明的测定法的测量值，来核对结果的相关性。结果显示在图1中。可以看 出，与在常规LTIA中相比，在本发明的测定法中，与化学发光酶免疫测定结果的偏差更小。
[0050] 工业实用性
[0051] 本发明使得可能在人胰岛素的乳胶凝集免疫测定中抑制血液样品测定中的非特 异反应。本发明的该效应是基于对通常用作pH缓冲剂的胺化合物的选择性使用，并且因 此，本发明不在试剂配方设计方面强加任何不必须的限制。这使得本发明高度可用于工业。
[0052] 对保藏的生物材料的引用
[0053] (l)FERM BP-11233
[0054] (2) FERM BP-11234
[0055] [关于保藏的生物材料的注意事项]
[0056] (1)产生66221抗体的杂交瘤66221
[0057] -保藏生物材料的保藏机构的名称和地址
[0058] 国家先进工业科学和技术研究所，国际专利生物保藏机构（The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology， International Patent Organism Depositary)
[0059] Chuo 6,1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本（邮政编码 305-8566)
[0060] -在保藏机构保藏生物材料的日期
[0061 ] 2009年4月8日（2009. 4. 8)(原始保藏日期）
[0062] 2010年2月17日（2010. 2. 17)(从原始保藏转为布达佩斯条约下的保藏的日期）
[0063] -保藏机构分配的登陆号
[0064] FERM BP-11233
[0065] (2)生产66226抗体的杂交瘤66226
[0066] -保藏生物材料的保藏机构的名称和地址
[0067] 国家先进工业科学和技术研究所，国际专利生物保藏机构
[0068] Chuo 6,Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本（邮政编码 305-8566)
[0069] -在保藏机构保藏生物材料的日期
[0070] 2009年4月8日（2009. 4. 8)(原始保藏日期）
[0071] 2010年2月17日（2010. 2. 17)(从原始保藏转为布达佩斯条约下的保藏的日期）
[0072] -保藏机构分配的登陆号
[0073] FERM BP-11234
【主权项】
1. 胰岛素测定法，所述测定法用于在含有两种以上具有pH缓冲作用的胺化合物的缓 冲液中利用固定有抗胰岛素抗体的颗粒进行免疫反应。2. 根据权利要求1所述的测定法，其中所述具有pH缓冲作用的胺化合物选自由 HEPES、MES和Tris组成的组。3. 根据权利要求1或2所述的测定法，其中所述缓冲液具有7. 3至7. 8的pH。4. 在胰岛素的颗粒凝集免疫测定法中抑制源自血液样品的非特异反应的方法，其中所 述方法包括在含有两种以上具有pH缓冲作用的胺化合物的缓冲液中利用固定有抗胰岛素 抗体的颗粒进行免疫反应。
【专利摘要】本发明解决这样的问题：提供用于人胰岛素的乳胶凝集免疫测定法和测定试剂，由此抑制血液样品测定过程中的非特异反应。通过携带抗胰岛素抗体的颗粒的免疫反应在含有两种以上类型的具有pH缓冲作用的胺化合物的缓冲液中进行。IPOD FERM BP-1123320100217
【IPC分类】G01N33/53, G01N33/543, G01N33/531
【公开号】CN105358976
【申请号】CN201480017397
【发明人】近藤纯一, 新山加菜美, 山本光章
【申请人】积水医疗株式会社
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年3月31日
【公告号】EP2980586A1, WO2014157723A1