多重乙肝试验的制作方法
【专利说明】多重乙肝试验
【背景技术】
[0001] 乙肝病毒导致肝病。很大比例的感染患者发展成慢性肝炎，导致肝损伤和后续的 肝癌。乙肝感染的特征在于数种独特血清学和免疫学应答。感染的时间概况可用作监测 疾病过程的有用指导并也可提供与疾病进程的血清学关联（参见例如，Elgouhari (2008) Cleveland Clinic J. Med. 75 :881 和 Juszczyk(2010)Vaccine 18 :S23)〇
[0002] 乙肝病毒含有两种主要病毒蛋白，表面抗原（HBsAg)和核心抗原（HBcAg)。感染 后，HBsAg首先变得可检测到，之后是出现宿主生成的抗-HBcIgM。抗-HBs抗体在HBsAg消 失几个月后出现，并且在无限期内保持可检测到。在"窗口期"期间（当出现HBsAg和出现 抗-HBs之间存在16-32周的间隔时），抗-HBc提供了目前或最近HBV感染的血清学证据。然 而，抗-HBc IgM和抗-HBc(IgM和IgG)的存在并不表明感染的消退或保护性免疫。抗-HBs 的出现和HBsAg的消失指示感染的消退和保护性免疫。此外，在没有HBsAg和抗-HBc存在 时存在抗-HBs指示成功接种疫苗的个体。
[0003] 乙肝血清学测试包括测量数种乙肝病毒特异性抗原和抗体。跟踪HBV感染和例如 在感染、爆发和消退之间分化的能力对于临床控制而言是重要的。所有市售的乙肝抗体测 试试剂盒在每个反应容器中于同一时间进行一个测试。任意给定的测试的结果不能预测乙 肝感染或消退的过程或阶段，因此必须进行多重测试，其浪费时间、样品和试剂。此外，药品 提供者可能不会命令立即测试所有的相关HBV标记物，使得对象可能会被召唤测试多次。 重复抽血是繁重且昂贵的，并且可导致不依从和不理想治疗。参见例如Stramer等，（2012) Transfusion 52 ：440〇
【发明内容】
[0004] 本文提供了用于在对象中同时检测多重乙肝病毒（HBV)抗体，使得能够确定对象 的HBV状态。本文所述的试剂盒提供了确定对象是否已经接触HBV、患有HBV感染、曾经患 有HBV感染、或已经针对HBV免疫的快速高效试验。这类试剂盒包含（a)包含或基本由固 体支持物（例如珠）的混合物组成的容器，其中混合物包含与HBsAg、HBcAg和抗-IgM之一 偶联的固体支持物；和（b)包含偶联剂1的容器（如下所述）。在一些实施方式中，混合物 中的三种类型的固体支持物（例如，珠）可互相区分，例如，不同的尺寸、密度、重量、吸光度 或可检测标记物。在一些实施方式中，混合物中的三种类型的固体支持物各自与不同的可 检测标记物偶联，例如，荧光标记物或荧光标记物的组合。在一些实施方式中，固体支持物 是磁力响应性的。在一些实施方式中，偶联剂1包含或基本由标记的HBsAg和标记的HBcAg 组成，其中HBsAg和HBcAg上的标记物是不同的或相同的，并且其中标记物用于间接检测 (例如，生物素、链霉生物素、毛地黄皂苷等）或直接检测（例如，荧光团或发光剂）。
[0005] 在一些实施方式中，该试剂盒还含包含偶联剂2的容器。在一些实施方式中，偶联 剂2包含或基本由与某一试剂偶联的可检测标记物组成，该试剂特异性结合偶联剂1中标 记的HBsAg和标记的HBcAg。例如，在一些实施方式中，偶联剂1包含或基本由生物素化的 HBsAg和生物素化的HBcAg组成，并且偶联剂2包含或基本由与可检测标记物，例如荧光团 如藻红蛋白（PE)或荧光素异硫氰酸酯（FITC)偶联的链霉亲和素。本领域技术人员将认识 到链霉亲和素和生物素可在之前的示例中切换或者被其它结合对代替。
[0006] 在一些实施方式中，该试剂盒还包含待加入样品的至少一种内部对照物，例如，在 容器中或在不同的容器中。在一些实施方式中，内部对照物是固体支持物，例如，珠，其中固 体支持物与某一试剂偶联，该试剂将结合样品中已知的分析物（样品验证对照物，例如针 对凝集因子如FXIII的抗体，其中样品是血液）。对于其它支持物，内部对照固体支持物也 将是可区分的，例如与不同的可检测标记物偶联，所述可检测标记物例如荧光标记物或荧 光标记物的组合。在这类实施方式中，偶联剂1还将包含标记的试剂以检测内部对照固体 支持物上的试剂-分析物结合，例如针对分析物的另一种抗体（例如，标记的抗-FXIII)。 在一些实施方式中，内部对照物标记物是不同或相同的，并且可以是用于直接或间接检测 的标记物。在一些实施方式中，内部对照物是固体支持物，例如，珠，其中固体支持物与可检 测标记物偶联，使得其可与其它固体支持物区分，例如，不同的荧光标记物或荧光标记物的 组合（内部标准对照物）。
[0007] 在一些实施方式中，该试剂盒还包含含有清洗试剂的容器（例如，即用、浓缩母液 或粉末）。在一些实施方式中，该试剂盒还包含含有用于流式细胞术的材料或试剂，例如，缓 冲剂、缓冲剂母液或粉末、合适的管等。在一些实施方式中，该试剂盒还包含含有至少一种 校准对照物的至少一个容器，例如用于设定被认为阳性的信号水平。在一些实施方式中，该 试剂盒包括对超过一种可检测标记物的校准对照物，例如珠上和偶联剂溶液中的可检测标 记物。在这种情况中，校准对照物可在一个容器或超过一个容器中。在一些实施方式中，该 试剂盒包括至少一种可检测标记物的多于一个水平的校准对照物，所述可检测标记物例如 珠上和偶联剂溶液中的可检测标记物。在一些实施方式中，该试剂盒还包含含有阴性对照 物，例如带有未标记的珠或未标记的偶联剂溶液的至少一个容器。
[0008] 该提供了确定抗-HBs、抗-HBc (总）和抗-HBc (IgM)的量，并且从而确定对象的 HBV感染状态的多重试验。因此，提供了处理来自对象（例如，哺乳动物，人）的生物样品的 试验或方法，包括（a)将生物样品在容器中与固体支持物的混合物接触，其中固体支持物 的混合物包含（i)与HBsAg偶联的固体支持物、（ii)与HBcAg偶联的固体支持物，和（iii) 与抗-IgM(例如，抗-人IgM)偶联的固体支持物；(b)从容器中去除非珠结合的组分；(c) 将固体支持物的混合物与偶联剂1接触；（d)去除非珠结合的组分；(e)任选地将珠的混合 物与偶联剂2接触；（f)任选地去除非珠结合的组分；和（g)通过流式细胞术检测固体支持 物上和偶联剂1(或2,如果存在）中的可检测标记物。使用步骤（g)的流式细胞术，可确定 来自对象的生物样品中抗-HBs、抗-HBc (总）和抗-HBc (IgM)和存在（阳性结果）或缺失 (阴性结果）和相对量。
[0009] 在一些实施方式中，混合物中的三种类型的固体支持物（例如，珠）可互相区分， 例如，不同的尺寸、密度、重量、吸光度或可检测标记物。在一些实施方式中，混合物中的三 种类型的固体支持物各自与不同的可检测标记物偶联，例如，荧光标记物或荧光标记物的 组合。在一些实施方式中，固体支持物是磁力响应性的。在一些实施方式中，偶联剂1包含 或基本由标记的HBsAg和标记的HBcAg组成，其中HBsAg和HBcAg上的标记物是不同的或 相同的，并且其中标记物用于间接检测（例如，生物素、链霉生物素、毛地黄皂苷等）或直接 检测（例如，荧光团或发光剂）。在一些实施方式中，偶联剂2包含或基本由与试剂偶联的 可检测标记物组成，该试剂特异性结合偶联剂1中标记的HBsAg和标记的HBcAg。
[0010] 在一些实施方式中，步骤（b)、（d)和（f)中的1个、2个或全部包括洗涤固体支持 物以去除非珠结合的组分。在一些实施方式中，生物样品选自血液、血液成分（例如，血清 或血浆）或经处理的血液。
[0011] 在一些实施方式中，该试验还包括通过流式细胞术检测至少一种校准对照物，其 中通过与至少一种校准对照物比较来确定对一个或多个可检测标记物是阳性和阴性的。在 一些实施方式中，阳性定义为高于校准对照物，并且阴性定义为低于校准对照物。在一些实 施方式中，该试验包括检测超过一种可检测标记物的校准对照物，例如珠上和偶联剂溶液 中的可检测标记物。在一些实施方式中，该试验包括检测超过一个水平的至少一种可检测 标记物的校准对照物，例如珠上和偶联剂溶液中的可检测标记物。在一些实施方式中，该试 验还包括通过流式细胞术检测至少一种阴性对照物，例如采用未标记的珠或未标记的偶联 剂溶液。
[0012] 在一些实施方式中，该试验还包括当与IgM偶联的固体支持物上偶联剂1 (或2， 如果存在）中可检测标记物是阳性时确定对象具有急性乙肝感染。在一些实施方式中，该 试验还包括当与HBsAg偶联的固体支持物上偶联剂1 (或2,如果存在）中可检测标记物是 阳性，但是在与HBcAg或IgM偶联的固体支持物上不是阳性时确定对象已经针对HBV免疫。 在一些实施方式中，该试验还包括当与HBcAg偶联的固体支持物上偶联剂1 (或2,如果存 在）中可检测标记物是阳性，但是在与HBsAg偶联的固体支持物上不是阳性时确定对象曾 接触HBV (但还没有保护性免疫）。在一些实施方式中，该试验还包括当与HbsAg和HBcAg 偶联的固体支持物上偶联剂1 (或2,如果存在）中可检测标记物是阳性，但是在与IgM偶联 的珠上不是阳性时确定对象曾感染HBV。
[0013] 还提供了确定对象的乙肝感染状态的多重试验，包括：(a)将来自对象的生物样 品在容器中与珠混合物接触，其中珠混合物包含（i)与人乙肝表面抗原（HBsAg)和可检测 标记物（i)偶联的珠，（ii)与人乙肝核心抗原（HBcAg)和可检测标记物（ii)偶联的珠，和 (iii)与对人IgM的特异性抗体（抗-IgM)和可检测标记物（iii)偶联的珠；(b)从容器中 去除非珠结合组分；（c)将珠混合物与偶联剂1接触，其中偶联剂1包含：（i)生物素化的 HBsAg，和（ii)生物素化的HBcAg ; (d)去除非珠结合的组分；（e)将珠混合物与偶联