用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒的制备和使用其的免疫测定法_2

文档序号:9602377阅读:来源:国知局
染料、颜料进行着色。另 外,由各种材质形成的着色成各种颜色的颗粒有市售,也可以使用这些市售着色颗粒。
[0033] 本发明中,对于上述的可见区着色不溶性载体颗粒用荧光色素进行标记。标记例 如可以使荧光色素作为荧光标记剂结合于可见区着色不溶性载体颗粒。所结合的荧光色素 的种类不受限定,可以使用在试药等领域中所使用的荧光色素。这时,荧光色素选择:自荧 光色素所发出的荧光在可视区着色颗粒中的吸收小的荧光色素。这是因为:如果自结合在 可见区着色颗粒上的荧光色素所发出的荧光色素被颗粒吸收,则无法将充分强度的荧光作 为来自颗粒的信号而进行测定。自荧光色素发出的荧光不被可见区着色颗粒吸收的荧光是 指,可见区着色颗粒吸收的光的波长区与自荧光色素发出的荧光的波长区不重叠。例如,使 用吸光光度计测定所使用的可见区着色颗粒的吸收光谱,可以使用发出可见区着色颗粒的 吸收小的波长区的荧光的荧光色素。可见区着色颗粒的吸收小的波长区是与该可见区着色 颗粒的吸收大的波长区的颜色处于补色关系的颜色的波长区,可以使用发出与下述颜色处 于补色关系的颜色的波长的荧光的荧光物质,所述颜色为与不溶性载体颗粒的吸光波长相 同波长的颜色。例如,红色颗粒由于反射红色光,所以人通过视觉识别为着色成红色。另一 方面,红色着色颗粒吸收与红色处于补色关系的颜色的光。红色光的波长为620~750nm 附近。与红色处于补色关系的颜色为从蓝色到绿色,蓝色光的波长为450~495nm附近,绿 色光的波长为495nm~570nm附近。因此,使用红色的可见区着色颗粒时,可以使用发出与从 蓝色到绿色处于补色关系的颜色的波长的荧光的荧光色素。与从蓝色到绿色处于补色关系 的颜色为从橙色到红色,其波长为590nm~750nm附近。因此,使用着色成红色的可见区着色 不溶性载体颗粒时,可以使用发出590nm~750nm、优选590nm~650nm的波长区的荧光的荧光 色素。
[0034] 另外,蓝色颗粒由于反射蓝色光,所以人通过视觉识别为着色成蓝色。另一方面, 蓝色着色颗粒吸收与蓝色处于补色关系的颜色的光。蓝色光的波长为450~495nm附近。 与蓝色处于补色关系的颜色为从橙色到红色,橙色光的波长为590~620nm附近,红色光的 波长为620~750nm附近。因此,使用蓝色的可见区着色颗粒时,可以使用发出与从橙色到 红色处于补色关系的颜色的波长的荧光的荧光色素。与从橙色到红色处于补色关系的颜色 为从蓝色到绿色,其波长为450nm~570nm附近。因此,使用着色成蓝色的可见区着色不溶性 载体颗粒时,可以使用发出450nm~570nm、优选500nm~550nm的波长区的荧光的荧光色素。 另外,蓝色颗粒由于600nm~700nm的吸收有变大的倾向,所以避开该波长区而优选发出比 600nm~700nm更低波长区的荧光的荧光色素。
[0035] 本发明中,利用吸光光度计测定待使用的可见区着色颗粒的吸收光谱,确定吸收 小的光的波长区,选择发出该波长区的荧光的荧光色素,用以下所记载的方法,结合于上述 可见区着色颗粒即可。通过使用这样的荧光色素,可以将自荧光色素发出的荧光向可见区 着色不溶性载体颗粒的吸收抑制得低,因此,可以获得充分的荧光强度。
[0036] 作为用于可见区着色颗粒的荧光标记的荧光色素,可举出具有荧光素 (fluorescein)、罗丹明(rhodamine)、香豆素(coumarin)、Cy dye、Alexa (登录商标) Fluor、EvoBlue、II惡嗪(oxazine)、Carbopyronin、萘(naphthalene)、耳关苯(biphenyl)、蒽 (anthracene)、菲(phenenthrene)、花(pyrene)、味唑(carbazole)等作为基本骨架的有机 荧光色素、该荧光色素的衍生物。另外,也可以使用铕(EU3+)螯合物、铽(Tb3+)螯合物等稀土 类络合物。作为铕(EU3+)螯合物可以使用具有氨基的4181六41]3+([4'-(4'-氨基-4-联苯 基)-2,2':6',2"-三联吡啶-6,6"-二基双(甲基亚胺二乙酰)]铕(111)41]3+,[4'-(4'-八111 ino-4-biphenylyl) -2, 2' : 6',2',-terpyridine_6, 6',_diylbis (methyliminodiacetato)] europate(III)-EU3+)等。并且,也可以使用绿色焚光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)等荧光蛋白。
[0037] 利用荧光色素的可见区着色颗粒的标记,可以通过以下方式进行:预先在上述的 可见区着色颗粒中导入羧基、氨基、磺酸基、硫醇基、醛基等官能团,并在上述荧光色素中也 导入官能团,通过官能团彼此间的结合反应使荧光色素结合于可见区着色颗粒。例如,可以 通过酰胺键使氨基与羧基结合、或通过二硫键使硫醇基彼此结合。另外,也可以使用交联 试剂使官能团彼此结合。作为交联试剂,可举出N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、EDAC (N- (3-二甲基氨基丙基)-Ν' -乙基碳二亚胺盐酸盐)、戊二醛等。另外,将稀土类络合物用 作荧光色素时,可以使用导入了氨基的ATBTA-EU3+等。并且,使用荧光蛋白时,既可以利用 官能团彼此间的结合,也可以利用物理吸附使荧光蛋白结合于可见区着色颗粒。导入了氨 基或羧基的荧光色素可以使用市售品。
[0038] 另外,也可以在可见区着色不溶性载体颗粒的主材料中预先混入荧光色素。例如, 通过混合等使荧光色素和可见区着色色素含有于成为不溶性载体胶乳颗粒的材料的树脂 等中,可以制备不溶性载体颗粒。并且,也可以用可见区着色色素标记荧光不溶性载体颗 粒。在此,所谓荧光不溶性载体颗粒,除了结合有荧光色素的不溶性载体颗粒以外,也包含 由能够发出荧光的物质形成的不溶性载体颗粒。作为这样的颗粒,例如可举出由铕(Eu)、 铽(几)等稀土类元素激活的1¥104或1115012(1 1是钇(¥)、镧(1^)或钆(6(1),111是铌 (Nb)、磷(P)或钒(V))构成的颗粒,可以使用日本特开2012-32263号公报中记载的物质。 另外,可见区着色色素是指,用人通过肉眼观察即可识别的颜色所着色的色素,可以使用能 够用于树脂等的染色中的公知的色素,例如可举出苏丹蓝、苏丹III、苏丹红IV、醌茜绿、油 溶橙等染料、颜料。例如,通过在成为不溶性载体胶乳颗粒的材料的树脂等中混合荧光色素 等而使之含有,从而制备不溶性载体颗粒,然后,可以用可见区着色色素进行染色。本发明 中,使用混入有这些荧光色素的主材料制造的可见区着色不溶性载体颗粒及用可见区着色 色素标记的荧光不溶性载体颗粒,均称作用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒。 即,所谓用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,包含发出荧光、且着色成可见区的 颜色的所有不溶性载体颗粒。
[0039] 可以用于本发明的荧光色素及其荧光波长(nm)示于括号内。荧光波长因测定条 件等而不同。可以在下述波长的土数十nm、例如±25nm的范围内进行测定。这些荧光色 素是一例,并不受这些限定。对于各种荧光色素可以基于其荧光波长而进行使用。
[0040] 有机荧光色素: Dylight405 (420)、DY-405 (420)、Cascade Blue (级联蓝)(420)、AlexaFluor405 (421)、AMCA (440)、Alexa-350 (442)、AMCA-X (447)、Pacific Blue (455)、Marine Blue (苯胺蓝)(460)、DY-415 (467)、Royal Blue (皇家蓝)(480)、ATT0425 (484)、Cy2 (505)、ATT0465 (508)、DY-475XL (509)、NorthernLights493 (514)、BODIPY 505/515 (515)、DY-490 (516)、Dylight488 (518)、Alexa-488 (519)、5-FITC (519)、FAM (520)、 DY-495-X5 (520)、DY-495 (521)、荧光素(Fluorescein) (521)、FITC (异硫氰酸荧光 素)(522)、ATT0488 (523)、HiLyte Flour488 (523)、MFP488 (523)、ATT0495 (527)、 OG-488 (524)、罗丹明(Rhodamine) 110 (525)、0G-514 (530)、0yster500 (530)、光谱 绿(Spectrum Green) (538)、Alexa-430 (541)、ATT0520 (545)、ATT0532 (553)、Cas Y (554)、Alexa-532 (554)、DY-500XL (555)、DY-485XL (560)、Alexa-555 (565)、HiLyte Plus 555 (552/567)、DyLight549 (568)、HiLyteFluor555 (568)、Cy3 (565)、Dylight547 (570)、罗丹明(Rhodamine) (570)、TRITC (570)、DY548 (572)、DY-554 (572)、DY-555 (572)、Alexa Fluor 546 (573)、DY-556 (573)、NorthernLights557 (574)、0yster550 (574) 、5-TAMRA (574)、DY-505-X5 (574)、DY-547 (574)、Oyster 556 (575)、DY-549 (575) 、Alexa-546 (575)、ATT0550 (576)、PE (578)、B-PE (578)、R-PE (578)、DY-560 (578)、TAMRA (580)、四甲基罗丹明(Tetramethyl rhodamine) (578)、RITC/TMR (580)、 MFP555 (585)、光谱橙(Spectrum Orange) (588)、DY-510XL (590)、若丹明(Rhodamine) B(590)、ATT0565 (592)、Cy3.5 (596)、R0XU:fcE|&(RhodamineRed)X)(599)、DY-590 (599)、5-R0X (602)、Alexa-568 (603)、BODIPY 580/605 (605)、光谱红(Spectrum Red) (612)、ECD (613)、Texas Red (615)、DyLight594 (61
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