用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒的制备和使用其的免疫测定法_4

文档序号:9602377阅读:来源:国知局
记剂的可见区着色聚苯乙烯颗粒显示出大致同等或非常低的强度。结合有铕螯合物荧光标 记剂的可见区着色聚苯乙烯颗粒中,就吸收光谱而言,615nm附近的吸收小的红色聚苯乙烯 颗粒、黄色聚苯乙烯颗粒的各1种显示出300以上的荧光强度,其次绿色聚苯乙烯颗粒显示 出160左右的强度,615nm附近显示强吸收的蓝色聚苯乙烯颗粒2种显示出100以下的强 度、较低。将结果不于表2中。
[0057] [表 2]
4.测定结合荧光素荧光标记剂的聚苯乙烯颗粒的荧光强度 将2.中所制备的结合荧光素荧光标记剂的聚苯乙烯颗粒用50mMTris (pH9.0)、 3%BSA稀释为0. 05%,将lOOyL加入到96孔的FluoroNunc plate的孔中,使用荧光多功能 微孔版检测仪(MTP-650FA;电晕电气株式会社制造)在490nm ex/530nm em下对荧光强度 进行了测定。作为对照,同时也对只是50mM Tris (pH9.0)、3%BSA、未结合荧光素荧光标记 剂的可见区着色聚苯乙烯颗粒进行了测定。
[0058] 该结果,与50mM Tris (pH9. 0)、3%BSA的荧光强度相比较,未结合荧光素荧光标记 剂的可见区着色聚苯乙烯颗粒显示出大致同等或非常低的强度。结合有荧光素荧光标记剂 的可见区着色聚苯乙烯颗粒中,就吸收光谱而言,530nm附近的吸收小的黄色聚苯乙烯颗粒 1种为500以上的强度,其次吸收小的绿色聚苯乙烯颗粒1种为170的强度,其次吸收小的 蓝色聚苯乙烯颗粒2种为70以上,在530nm附近显示强吸收的红色聚苯乙烯颗粒强度低。 将结果示于表3中。
根据以上的结合有铕螯合物荧光标记剂及氨基荧光素荧光标记剂的着色聚苯乙烯颗 粒的吸收光谱和荧光强度的结果明确了:结合于不溶性载体颗粒而可以高效率地检测荧光 的是,使荧光标记剂结合于对所结合的荧光物质的荧光波长的吸收小的不溶性载体颗粒的 情况,而具有强吸收的不溶性载体颗粒无法高效率地测定荧光。
[0060] 实施例2抗A型流感病毒NP抗体及荧光标记剂与具有羧基作为官能团的可见区 着色聚苯乙烯颗粒的结合、以及基于使用该结合的免疫色谱法的A型流感病毒NP抗原的检 测 实施例2中,对可见区着色聚苯乙烯颗粒进行了比较,将视见度高的红色聚苯乙烯颗 粒及蓝色聚苯乙烯颗粒I作为材料实施了验证。
[0061] 1.制备抗A型流感病毒NP单克隆抗体 用A型流感病毒抗原对BALB/c小鼠进行免疫,自饲养了一定期间的小鼠摘出脾脏,根 据 Kohler 等的方法(Kohler et al·,Nature, vol, 256,p495_497 (1975))与小鼠骨 髓瘤细胞(P3X63)融合。将所得的融合细胞(杂交瘤(hybridoma))保持在37°C培养箱 (incubator)中,边通过ELISA确认上清液的抗体活性边进行了细胞纯化(单克隆化),所 述ELISA使用了将A型流感病毒NP抗原固相化的板。将所取得的2株该细胞分别腹腔给 予经降植烷(pristane)处理的BALB/c小鼠,约2周后,采集了含有抗体的腹水。
[0062] 通过使用蛋白A柱的亲和色谱法,从所得腹水中分别纯化IgG,获得了 2种类的纯 化抗A型流感病毒NP抗体。
[0063] 2.抗A型流感病毒NP抗体在硝酸纤维素膜上的固化 将经纯化的抗A型流感病毒NP抗体用纯化水稀释为1. 0mg/ml,将所得稀释液线状涂 布于用PET膜作衬里的硝酸纤维素膜(Unisart CN 95 ;Sartorius Stedim Biotech公司制 造)的规定位置上,于45°C干燥30分钟,获得了抗A型流感病毒NP抗体固化膜(以下称作 抗体固化膜)。
[0064] 3.抗A型流感病毒NP抗体与荧光标记物质在可见区着色聚苯乙烯颗粒上的固化 将在向硝酸纤维素膜的固化中未使用的另一个经纯化的抗A型流感病毒NP抗体用纯 化水稀释为1. 〇mg/ml,向其中加入红色聚苯乙烯颗粒或蓝色聚苯乙烯颗粒I使之为0. 1%, 搅拌后,进一步向红色聚苯乙烯颗粒和抗体的混合液中加入了作为铕螯合物荧光标记剂的 ATBTA-Eu3+(东京化成工业株式会社制造)使之为0. lmg/mL。另一方面,向蓝色聚苯乙烯颗 粒I和抗体的混合液中加入6-氨基荧光素(东京化成工业株式会社制造)使之为0. lmg/ mL,进行了搅拌。向各自中加入碳二亚胺使之为1%,进一步进行了搅拌。在室温下反应了 1 小时。在7000g下离心30分钟后,除去上清液,再浮游于50mM Tris (pH9. 0)、3%BSA中,获 得了抗A型流感病毒NP抗体+结合铕螯合物的红色聚苯乙烯颗粒、以及抗A型流感病毒抗 体+结合荧光素的蓝色聚苯乙烯颗粒。
[0065] 4.通过免疫色谱法检测A型流感病毒NP抗原 将2.中所得的抗体固化膜贴合于底板(backing sheet)、吸收带、结合垫(conjugate pad)、样品垫(sample pad)上,获得了试验片。
[0066] 将3.中所得的抗A型流感病毒NP抗体+结合铕螯合物的红色聚苯乙烯颗粒、以 及抗A型流感病毒抗体+结合荧光素的蓝色聚苯乙烯颗粒用50mM Tris (pH9. 0)、3%BSA稀 释为〇. 1%,获得了稀释红色颗粒及稀释蓝色颗粒。
[0067] 将A型流感病毒NP抗原用检体悬浮液(10mM Tris (pH7.0)、3%BSA、0.2%Triton χ-ioo)稀释,制备了抗原稀释液。
[0068] 将100 μ L上述抗原稀释液与5 μ L稀释红色颗粒或5 μ L稀释蓝色颗粒混合,将总 量分别滴加到试验片的样品垫上。静置15分钟后,通过目视确认了测试线(test lines) 的有无,进而在UV透照仪(transilluminator) (Benchtop 2UV transilluminator ;UVP 公 司制造)上,通过目视对荧光进行了确认。稀释红色颗粒中,将仅结合有抗A型流感病毒NP 抗体的红色聚苯乙烯颗粒作为对照,进行了检测限的比较研究。
[0069] 该结果,在用不包含抗原的检体悬浮液进行试验的试验片中,目视、基于UV透照 仪的荧光均无法确认到测试线,在用包含抗原的检体悬浮液进行试验的试验片中,通过目 视可以确认到着色的测试线,并且可以确认到基于UV透照仪的荧光的测试线。将结果示于 表4中。
并且,使用了仅结合有抗A型流感病毒NP抗体的红色聚苯乙烯颗粒与稀释红色颗粒的 检测限的比较研究的结果,基于着色目视判定的检测限未改变,在荧光目视判定中,可以获 得2倍高的灵敏度。将结果示于表5中。
根据以上结果明确了 :通过将由本法制备的结合荧光物质的着色颗粒用于免疫色谱法 中,基于目视的着色测试线的判定和使用装置的荧光测试线的测定是可能的。并且,本实施 例中虽通过目视对荧光进行判定,但认为通过使用装置进行检测可以更高灵敏度地检测。
[0072] 产业上的可利用性 本发明的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒可以用于免疫色谱法等免疫 测定中。
[0073] 将本说明书中引用的所有刊物、专利及专利申请直接作为参考而采纳到本说明书 中。
【主权项】
1. 用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其为用于免疫测定的用荧光色素标 记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,基于该可见区着色不溶性载体颗粒的上述荧光色 素发出的波长区的荧光的吸收小。2. 权利要求1所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,用于标记 的荧光色素为发出与下述颜色处于补色关系的颜色的波长的荧光的荧光物质,所述颜色为 与可见区着色不溶性载体颗粒的吸光波长相同波长的颜色。3. 权利要求1或2所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,可见区 着色不溶性载体颗粒为着色成蓝色的颗粒,荧光色素所发出的荧光的波长为450nm~570nm。4. 权利要求3所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,可见区着 色不溶性载体颗粒为着色成蓝色的颗粒,荧光色素为荧光素或异硫氰酸荧光素。5. 权利要求1或2所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,可见区 着色不溶性载体颗粒为着色成红色的颗粒,荧光色素所发出的荧光的波长为590nm~750nm。6. 权利要求5所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,可见区着 色不溶性载体颗粒为着色成红色的颗粒,荧光色素为atbta-eu3+。7. 权利要求1~6中任一项所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其 中,不溶性载体颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒。8. 免疫测定方法,其使用了权利要求1~7中任一项所述的用荧光色素标记的可见区着 色不溶性载体颗粒。9. 权利要求8所述的免疫测定方法,其包含:使权利要求1~7中任一项所述的用荧光 色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒结合于包含待测定的抗原或抗体的抗原抗体复合 物,通过目视观察不溶性载体颗粒的着色、和/或测定自不溶性载体颗粒所发出的荧光,来 确定抗原抗体复合物的存在。10. 权利要求8或9所述的免疫测定方法,其为免疫色谱法。11. 免疫测定试剂盒,其包含权利要求1~7中任一项所述的用荧光色素标记的可见区 着色不溶性载体颗粒。12. 制备权利要求1~7中任一项所述的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒 的方法,该方法包括下述工序: (i) 测定可见区着色不溶性载体颗粒的吸收光谱的工序; (ii) 确定该可见区着色不溶性载体颗粒的吸收少的波长区的工序; (iii) 选择发出该波长区的荧光的荧光色素的工序;以及 (iv) 用所选择的荧光色素标记上述可见区着色不溶性载体颗粒的工序。
【专利摘要】本发明的目的在于,提供用于快速、高灵敏度的免疫测定、也可以目视判定且可以高灵敏度装置测定的不溶性载体颗粒。用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其为用于免疫测定的用荧光色素标记的可见区着色不溶性载体颗粒,其中,基于该可见区着色不溶性载体颗粒的上述荧光色素发出的波长区的荧光的吸收小。
【IPC分类】G01N21/64, G01N33/545, G01N33/543
【公开号】CN105358980
【申请号】CN201480026554
【发明人】宫泽恭
【申请人】电化生研株式会社
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年5月9日
【公告号】EP2995954A1, US20160116481, WO2014181863A1
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