一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
【技术领域】
[0001] -种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒 素A的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中赭曲霉毒素A进行检测。
【背景技术】
[0002] 赭曲霉毒素（Ochratoxins，0T)是由曲霉属和青霉属中的某些菌种产生的有 毒代谢物，是异香豆素联结L-苯丙氨酸在分子结构上类似的一族化合物。赭曲霉毒素 (0T)主要包括赭曲霉毒素A(0ΤΑ)、赭曲霉毒素Β(0ΤΒ)、赭曲霉毒素C(0TC)、赭曲霉毒素 D(OTD)等七种，其中以0ΤΑ为主，0ΤΑ的毒性最强、污染最为严重、分布最为广泛。0ΤΑ主 要由纯绿青霉（PenicilliumVerrucosum)、赫曲霉（Aspergillusachraceus)和碳黑曲霉 (A.carbonarius)三种真菌产生。主要危及人和动物的肾脏，动物实验表明：0ΤΑ是一种具 有强烈肾脏毒性和肝脏毒性的真菌毒素，并具有致癌、致畸、致突变、神经毒性和免疫抑制 等毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。0ΤΑ在自然界分布广泛，主要存在于粮谷类 食品、咖啡、牛奶、啤酒、茶叶等中。因此，建立准确、灵敏、快速的0ΤΑ检测技术对于食品安 全具有重大意义。
[0003] 目前检测0ΤΑ的主要方法有薄层色谱法（TLC)、高效液相色谱法（HPLC)、液相色谱 质联用法（LC-MS/MS)、酶联免疫吸附法（ELISA)和胶体金免疫层析分析法（GICA)等。ELISA 主要用于0ΤΑ现场快速检测和大批量样品筛选，它与GICA-样都是基于抗原抗体亲和反 应，一抗体作为识别分子。但抗体易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经 过动物或者细胞实验，繁琐费时，成本较高，相应的检测成本也偏高。所以开发一种快速方 便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法是很有必要的。
[0004] 核酸适配体（Aptamer)通过指数富集配体系统进化（systematicevolutionof ligandsbyexponentialenrichment，SELEX)技术从体外筛选得到的，能与相应配体专一 性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。这种寡核苷酸序列形成的高级结构能够识别与之对 应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比，适配体 的靶分子范围广，体外筛选，易人工合成和修饰，分子较小，稳定性好，对温度不敏感，容易 保存，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食 品安全中得到广泛应用。
[0005] 近年来纳米材料与分析化学两者的结合越来越紧密，新型纳米材料在分析检测中 的发展前景也越来越广大，并涌现出了很多具有优秀特性的纳米材料。其中上转换发光纳 米材料和金纳米棒具备独特的功能被人们所熟知。
[0006] 上转换发光纳米材料（UpconversionNanoparticles)的发光机理是基于双光子 或者多光子机制将长波长的激发光转换成短波长的发射光的过程，是一种将红外光转变成 可见光的有效途径。相对于传统的有机荧光染料和其他荧光纳米材料，上转换发光纳米材 料作为完全惰性的无机发光材料具有很大的优势，光化学稳定，检测背景低，穿透性强，可 以选择不同的基质材料和掺杂离子来调节上转换发光，真正实现单激发多发射，有利于生 物体系中多组分同时检测。鉴于上述优点，上转换发光纳米材料已成为一种优秀的生物标 记材料。金纳米棒在紫外-可见-近红外（UV-Vis-NIR)波段具有独特的可调节表面等离 子体共振（SPR)光学性质，其良好的稳定性、低生物毒性、亮丽的色彩和在催化、生物医药、 分析化学、食品安全等领域广阔的应用前景受到了广泛关注。
[0007] 本发明首先通过调节金纳米棒的纵向表面等离子体共振吸收峰的位置，合成了能 够与上转换发光纳米材料的发光光谱实现有效重叠的金纳米棒，纵向等离子体共振吸收峰 峰为660nm左右，并分别在上转换纳米材料上修饰0ΤΑ适配体和在金纳米棒上修饰互补寡 核苷酸链，分别组成能量供体探针和能量受体探针，基于两者碱基互补配对原则，使得能量 供体探针和能量受体探针之间的距离拉近，发生发光共振能量转移，实现上转换发光信号 的淬灭。当加入不同数量的0ΤΑ时，0ΤΑ与适配体进行特异性结合，使得双链结构解离，上转 换发光纳米材料与金纳米棒之间的距离变大，上转换发光信号得以恢复，以980nm激光作 为激发光源记录上转换发光检测信号，通过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品的检测，建立 标准曲线，达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。该发明可以用于啤酒、玉米、 谷物、饲料及其制品等样品中赭曲霉毒素A含量的检测。
【发明内容】
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[0008] -种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒 素A的方法：分别制备得到NaYF4:Yba2S6,EraffiS6上转换发光纳米材料和金纳米棒（纵横比 为2. 5)，对上转换发光纳米材料进行表面功能化修饰并与亲和素（Avidin)偶联，随后金纳 米棒利用Au-S键的作用与巯基化适配体互补寡核苷酸链结合成为能量受体探针，上转换 发光纳米材料通过亲和素（Avidin)与生物素（Biotin)之间的作用与生物素（Biotin)修 饰的适配体DNA特异性结合称为能量供体探针。将两者经过一段时间的孵育，通过DNA互补 杂交使得两者组装成为复合纳米材料，发生发光共振能量转移，实现上转换发光信号的淬 灭，利用980nm激光激发，此时的发光信号为最小值。当加入目标分析物赭曲霉毒素A时， 适配体DNA的空间构象发生改变，与赭曲霉毒素A发生特异性结合，使得适配体DNA与互补 单链DNA解链，从而导致上转换发光纳米材料与金纳米棒分离，此时再对此溶液进行检测， 得到发光信号增大。在一定范围内赭曲霉毒素A的含量与发光信号的增大的数值相关，基 于此对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对实际样品中赭曲霉毒素A进 行定量检测的目的；步骤为：
[0009] (1)通过高温热解法技术，制备似￥?4別。. 28644_上转换发光颗粒，并对其做表 面修饰。称取一定量的YC13 ·6Η20,YbCl3 ·6Η20，ΕΚ：13αη:68· 54mol%Υ3+，28· 6mol%Yb3+， 2.86mol%Tm3+;总共lmmol)于三口烧瓶中，加入6mL油酸以及15mL1-十八稀。磁力搅拌 条件下，逐渐升高温度至160°C，待混合液形成均一的溶液后，自然冷却至室温。准确称取 〇.lg氢氧化钠和〇. 1482g氟化铵，溶于10mL甲醇溶液混合均匀。将上述溶液缓慢加入到三 口烧瓶中，磁力搅拌30min后，缓慢蒸发甲醇，脱气后，将混合液加热至300°C，并且持续lh。 反应结束后，自然冷却至室温，离心收集材料，用环己烷和乙醇清洗三次，储存备用。
[0010] (2)利用配体交换法对上转换发光纳米颗粒进行表面羧基化修饰。取30mL二甘 醇，300mg聚丙烯酸（Mw= 2000)加入到三口烧瓶中，加热至110°C，形成澄清透明溶液后， 缓慢加入lOOmg油酸包被的上转换纳米材料甲苯溶液，在氩气保护下，110°C持续lh，升温 至240°C持续2h，带溶液冷却至室温后，加入乙醇沉淀材料，离心收集材料用乙醇和水清洗 三遍。
[0011] (3)采用两步种子法制备金纳米棒。金纳米棒的制备分为两步，第一步为金种 子溶液的制备，首先向7. 5mL0. 05M十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)溶液中加入0. 122mL 0. 0237M氯金酸溶液，摇匀后成深黄色，迅速向其中加入新鲜冰水配制的0. 6mL0. 01M硼氢 化钠溶液，剧烈振荡2min，溶液成浅棕色，反应过程中有气体跑出，注意放气，最后将种子置 于40°C水浴中静置2h后使用。第二步是金纳米棒的生长，向试管中加入30mL0.05M十六 烷基三甲基溴化铵溶液，然后加入70μL0. 01M硝酸银溶液和0. 735mL0. 0237M氯金酸溶 液，摇匀后，溶液呈亮黄色，再向其中加入0. 24mL0. 1M抗坏血酸溶液，轻轻摇匀，溶液由亮 黄色变为无色，此为生长溶液。最后加入〇.3mL用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)稳定的金 种子溶液，轻轻振荡lmin，静置3h完成生长，得到长径比为2. 5左右的金纳米棒，横向和纵 向等离子共振吸收峰分别为515nm和660nm左右，将制备好的金纳米棒离心收集，用超纯水 清洗三次，于4°C冰箱保存。
[0012] (4)利用EDC/NHS法将羧基化上转换发光纳米材料与亲和素（Avidin)偶联。称 取5mg聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料分散于5mLMES(pH5. 6)缓冲液中，超声15min，加入 0. 6mL2mg/mLEDC溶液和0. 2mL2mg/mLNHS溶液，37°C摇床中活化2h。离心收集材料，用 10mM磷酸缓冲液清洗三次。然后分散于磷酸缓冲液中，加入lmL0.5mg/mL亲和素溶液，在 37 °C摇床中反应12h。反应结束后清洗数次，弃上清。
[0013] (5)利用通过亲和素（Avidin)与生物素（Biotin)之间的特异性结合将表面修饰 亲和素（Avidin)的上转换发光纳米颗粒与生物素（Biotin)修饰的赭曲霉毒素A适配体 DNA单链连接。具体方法为：将亲和素修饰的上转换纳米材料分散于5mL磷酸缓冲液中，加 入一定量的生物素化赭曲霉毒素A适配体，在37°C摇床中孵育12h，离心收集材料和上清， 用磷酸缓冲液清洗三次，分散于BB缓冲液（10mMTris，pH8. 5，120mMNaCl，5mMKC1和20m