一种生物素酶酶活性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶活性的检测方法，具体涉及一种生物素酶酶活性的检测方法， 属于生物医药检测领域。
【背景技术】
[0002] 生物素（Biotin)又称为维生素B7、维生素H、辅酶R，是一种水溶性的含硫维生 素。生物素是体内4种羧化酶的辅酶，包括糖代谢中的关键酶丙酮酸羧化酶、催化脂肪酸 合成第一步反应的乙酰辅酶A羧化酶、在蛋白质代谢中起重要作用的丙酰辅酶A羧化酶和 β-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶。生物素的缺乏将导致上述酶活性缺失，引起体内糖、脂及蛋 白质三大营养物质代谢异常，出现线粒体能量合成障碍，引起代谢性酸中毒、有机酸尿症及 一系列神经与皮肤系统损害，严重时致死。另外，生物素还是组蛋白的重要修饰成分，参与 基因表达与DNA修复等过程。
[0003] 生物素酶是一种糖蛋白，广泛存在于血清、白细胞、成纤维细胞及肝脏等组织中。 生物素酶的主要功能是水解食物中及机体代谢产生的生物胞素和生物素-肽，产生游离的 生物素。虽然生物素在食物中广泛存在，但绝大部分是以蛋白结合态存在，因此，生物素酶 缺陷将导致机体既无法从食物中摄取生物素又无法再生机体代谢产生的生物素，最终使机 体缺乏生物素，引起体内糖、脂及蛋白质代谢异常，即出现生物素酶缺乏症（Biotinidase deficiency，BD)，也称迟发型多羧化酶缺乏症。
[0004] 生物素酶缺乏症是一种常染色体隐性遗传疾病，发病年龄一般在1周至10岁，平 均年龄3. 5个月，但也有几年后仍无明显症状的。生物素酶缺乏症临床表现复杂，涉及神经 系统、呼吸系统、皮肤系统，出现发育滞后、视力及听力下降等，患者间症状差异较大；生化 异常包括代谢性酸中毒、有机酸尿症及高氨血症等，严重时出现昏迷甚至死亡。根据血浆残 余生物素酶活性大小，可将生物素酶缺乏症分成两种类型，即严重缺乏型（酶活性〈10%正 常人平均值）和部分缺乏型（酶活性处于正常人平均值的10%~30% )。据1991年的统 计，生物素酶缺乏症的全球发病率约为1/60, 000,但不同地区间发病率差异很大，例如希腊 高达1/4, 508、土耳其为1/11，000、欧洲10个国家的整体发病率为1/47, 486。在我国尚无 发病率统计，仅有约20例临床病例报道，根据病例分布推测，本病在我国的发病率可能存 在南北差异。口服游离生物素可以改善或阻止生物素酶缺乏症的临床症状，疗效显著且无 毒副作用。若能及时确诊患者，并终生补充生物素进行预防治疗，患者将正常生长发育而不 受任何影响，但若诊断较晚，出现发育滞后、视力及听力等器质性损伤时，这些症状将无法 恢复。因此，早期确诊并进行预防治疗，是防治生物素酶缺乏症的关键。
[0005] 由于生物素酶缺乏症临床表现复杂多样，且与许多其它疾病在临床表现上有很多 相似之处（如皮疹等），容易被误诊；另外，部分缺乏型患者往往只在受压（如感染等）情 况下才表现出症状，因此不易发现，但他们始终存在发病风险。若未得到正确及时的诊治， 致病及致死率均较高。因此，建立生物素酶缺乏症的诊断方法，对患者做出早期诊断，对改 善生物素酶缺乏症患者生存质量、提高我国人口出生素质具有重要意义。
[0006] 生物素酶缺乏症可从3个方面进行分析诊断，即生物素酶酶活性分析、体内代谢 物水平分析及基因分析，但后两者只能作为生物素酶缺乏症诊断的辅助或确证手段。因为 基于代谢物水平很难将生物素酶缺乏症与其它疾病进行区分（如全羧化酶合成酶缺乏症 等），而且代谢物水平常受到发病状态、饮食及用药等影响，因此基于代谢物水平分析的串 联质谱技术等方法只能作为生物素酶缺乏症辅助诊断措施。对于基因水平的分析，由于存 在单核苷酸多态性等原因，常常给基因分析带来不确定性；另一方面，基因的表达翻译及功 能的实现往往需要一些其它分子或蛋白的参与或修饰，有很多这类机制目前还未完全被揭 示，因此基因分析也不能作为诊断的可靠依据，只适用于对生物素酶缺乏症的确证及分型。 而酶活性水平分析则基本不存在上述问题，不仅特异性高，而且不受发病状态等影响，因 此，对生物素酶缺乏症的诊断主要是基于生物素酶的酶活性分析，是生物素酶缺乏症诊断 的金标准。
[0007] 目前，国际上采用的生物素酶活性分析方法多以人工底物类似物N-生物素-P-氨 基苯甲酸为反应底物，通过检测其酶促水解产物P-氨基苯甲酸的衍生物的吸光值来检测 酶活性，此方法较经济，但磺胺类药物会使检测结果出现假阴性。另外一种可用于生物素酶 活性筛查的反应底物为生物素-6-氨基喹啉，同样是一种人工底物类似物，通过检测其酶 促水解产物氨基喹啉的荧光值来检测酶活性，该方法成本较高，且可因较高的白蛋白浓度 及使用某些抗生素而出现假阳性，另外，高甘油三酯浓度会使结果出现假阴性。其它方法还 有以荧光及放射性标记的生物素衍生物等为底物的，但均存在费用较高、操作更复杂、更费 时等问题。值得注意的是，上述方法中均是以人工底物类似物作为反应底物，Ebrahim等研 究发现，以天然底物生物胞素为反应底物时，酶活性较人工底物高30±5%。因此，以生物胞 素为底物时，检测方法具有更高的检测灵敏度及更宽的检测限，且更能反映样本中生物素 酶活性的真实水平。
[0008] 但是，Ebrahim等建立的方法只能用于血清样本的检测，样本用量大，酶活性稳定 时间短，且检测前还必须对样本进行透析处理，操作复杂。以上的不足导致该方法无法应用 于新生儿筛查，但如前所述，生物素酶缺乏症必需得到及时的诊治，否则将出现不可逆的损 伤。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种生物素酶（Biotinidase，EC3. 5. 1. 12)酶活性的检测 方法，本发明的检测方法，是以生物胞素为底物，因此具有较高的检测灵敏度及更宽的检测 限；并且不需要对样本进行任何形式的前期处理，可直接用于酶活性检测，方便快捷；可在 半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用本发明试剂盒，比较方便。
[0010] 本发明提供的酶活性的检测方法，包括如下步骤：
[0011] 1)将样本加入至试剂1和试剂2中进行反应；反应结束后加入试剂3进行终止反 应；将所述反应后的体系进行离心分离，向得到的上清液中加入试剂4进行中和至pH值为 7~11 ;向所述中和后的体系中加入试剂5进行衍生反应；检测所述衍生反应后的体系在 激发波长300~500nm和发射波长400~600nm下的焚光值；
[0012] 2)将样本加入至所述试剂1中进行反应；反应结束加入所述试剂2后，立即加入 所述试剂3进行终止反应；将所述反应后的体系进行离心分离，向得到的上清液中加入所 述试剂4进行中和至pH值为7~11 ;向所述中和后的体系中加入所述试剂5进行衍生反 应；检测所述衍生反应后的体系在激发波长300~500nm和发射波长400~600nm下的荧 光值，作为空白对照的荧光值；
[0013] 所述反应与步骤1)中所述反应的条件相同；
[0014] 所述终止反应与步骤1)中所述终止反应的条件相同；
[0015] 所述衍生反应与步骤1)中所述衍生反应的条件相同；
[0016] 3)将至少8种不同浓度的赖氨酸分别与所述试剂5进行所述衍生反应，并检测所 述衍生反应后的体系在激发波长300~500nm和发射波长400~600nm下的荧光值；以赖 氨酸的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线；
[0017] 所述衍生反应与步骤1)中所述衍生反应的条件相同；
[0018] 4)根据步骤1)中所检测的荧光值与步骤2)中作为空白对照的荧光值的差值和所 述标准曲线，即得到步骤1)中进行所述衍生反应的赖氨酸的浓度，进而得到所述样本中生 物素酶的酶活性；
[0019] 所述酶活性的单位定义为：以每L样本每小时水解所述生物胞素生成的赖氨酸的 微摩尔数，表示为ymol/L/h;
[0020] 所述试剂1为由缓冲液1和酶活稳定剂组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为 3 ~11 ;
[0021 ] 所述试剂2为生物胞素；
[0022] 所述试剂3为终止液；
[0023] 所述试剂4为中和液；
[0024] 所述试剂5为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1，2-二乙酰 苯、茚三酮、荧光胺和邻苯二醛中任一种。
[0025] 上述的检测方法中，所述试剂1中，所述缓冲液1的摩尔浓度可为50~500mmol/ L，所述酶活稳定剂的摩尔浓度可为1~50mmol/L;
[0026] 所述试剂2中，所述生物胞素的摩尔浓度可为0. 05~2mmol/L;
[0027] 所述试剂3中，所述终止液的质量百分含量可为30%~70% ;
[0028] 所述试剂4中，所述中和液的摩尔浓度可为0. 2~2mol/L;
[0029] 所述试剂5中，所述缓冲液2的摩尔浓度可为50~500mmol/L，所述衍生底物的质 量百分含量可为0. 05%~5%。
[0030] 上述的检测方法中，所述试剂1中，所述缓冲液1的摩尔浓度可为200mmol/L，所述 酶活稳定剂的摩尔浓度可为10mm〇l/L;
[0031] 所述试剂1的pH值为5. 5 ;
[0032] 所述试剂2中，所述生物胞素