一种dna标记抗体的方法

文档序号:9615184阅读:2609来源:国知局
一种dna标记抗体的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种DNA标记抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 目前应用的DNA抗体偶联系统主要有:(1)链亲和素化抗体/蛋白A-生物素化 DNA系统:Sano等用链亲和素/蛋白A基因工程融合蛋白作为连接分子来连接生物素标记 的DNA与抗体,此种融合蛋白的链亲和素部分可识别DNA上的生物素,蛋白部分可识别抗体 的Fc段。但Ruzicka认为蛋白A不但可以结合特异性抗体的IgG,而且还可以与样品中吸 附于固相的无关抗体IgG结合,从而降低了反应的特异性,而且链亲和素/蛋白A融合蛋白 没有商品化,不易进行推广。(2)生物素化抗体-亲和素-生物素化DNA系统:国内外更多 的研究人员使用亲和素系统来连接DNA与抗体。这种偶联系统是由Ruzicka等率先引入免 疫PCR技术的。其基本方法是先将亲和素和生物素化的DNA预结合成复合物,然后与结合固 相的生物素化的特异性抗体结合。但是1个亲和素分子可以结合4个生物素分子,因此亲 和素和生物素化的DNA预结合成复合物是高度不均一的,从而降低了准确性和可重复性。 大多数学者采用分别加入生物素化抗体、游离亲和素和生物素化DNA分子的方法克服了以 上缺点,但延长了检测周期,使检测步骤繁琐,增加了系统误差。(3)抗体-叶绿素-DNA系 统:利用自然界广泛存在的叶绿素作为连接分子进行抗体与DNA的交联。这种方法具有较 好的稳定性,且成本低,但该法叶绿素的提取和纯化及除交联外的其他过程均需在黑暗处 进行,而交联却需在特定光下进行,故实际操作中很不方便。(4)抗体-DNA系统:还有一些 学者用化学交联剂直接将DNA与抗体连接起来。使用的交联剂有聚乙烯亚胺和碳化二亚胺 等一些双功能交联剂,Joerger等的大致步骤是先将抗体马来酰亚胺化和DNA分子乙酰硫 代乙酰化,然后将两者在黑暗条件下进行偶联,最后对交联产物进行纯化。该方法完全摆脱 了生物素-亲和素系统的本身价态而造成的灵敏度和准确性下降的问题,也免去了几次洗 涤步骤,减少了指示系统与固相载体的非特异结合,节省了时间。常用的偶联方法如戊二醛 法、碳二亚胺法法等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物,致使偶联效率 降低、结合物活性减弱。

【发明内容】

[0003] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种DNA标记抗体的方 法。
[0004] 为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:
[0005] -种DNA标记抗体的方法,采用异型双功能交联剂活化的抗体偶联疏基化DNA。
[0006] 进一步地,所述巯基化DNA的制备方法是利用巯基化引物和普通引物不对称PCR 扩增得到。
[0007] 进一步地,所述不对称PCR扩增的巯基化引物和普通引物的比例为50:1。
[0008] 进一步地,所述异型双功能交联剂,一端是马来酰亚胺基团,一端是琥珀酰亚胺基 团。
[0009] 进一步地,所述异型双功能交联剂包括MBS、Sulfo MBS、GMBS、Sulfo GMBS、EMCS、 Sulfo EMCS、SMCC、Sulfo SMCC、SMPB 和 Sulfo SMPB〇
[0010] 进一步地,所述采用异型双功能交联剂活化的抗体制备方法为:将透析过的抗体 和异型双功能交联剂按摩尔比以1:5的混合,异型双功能交联剂浓度2mg/L,25°C搅拌反应 1小时。
[0011] 进一步地,先将巯基化标记DNA的二硫键用还原剂打断,脱盐后立即和活化的抗 体等摩尔数混合,25°C反应1小时,加入10yL lm〇l/Li3-巯基乙醇终止反应,25°C反应 30min后纯化。
[0012] 进一步地,所述的纯化方法为磁珠法,在PCR产物和抗体的偶联物混合液中加入 羧化的磁粒,然后用PEG/NaCl沉淀,使目的DNA吸附至磁珠,最后磁场分离被吸附的DNA,经 乙醇洗涤和用水洗脱完成纯化。
[0013] 本发明提供的DNA标记抗体的方法,采用异型双功能试剂作为偶联剂偶联抗体和 DNA,制备的DNA标记抗体可以用于免疫PCR试验,有反应步骤简单,偶联效率高等优点。虽 然需要针对每一个特殊分析的抗体进行标记纯化,而且标记纯化过程比较繁琐,但当大量 标记后进行推广时,标记纯化过程比较繁琐的缺陷也就不突出了;而且检测多种成分可以 共用相同的指示系统和检测系统,进一步有利于标准化。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1提供的免疫PCR反应后的电泳条带,可见泳道1位置200bp 左右有明显扩增条带,证明DNA和抗体的偶联是成功的。
【具体实施方式】
[0015] 本发明实施例提供一种DNA标记抗体的方法,采用异型双功能交联剂活化的抗体 偶联巯基化DNA,通过合成巯基化引物来扩增得到巯基化的DNA片段。
[0016] DNA和抗体属于两类不同的生物分子,特别是DNA,由脱氧核糖和碱基对组成,不 含有通常用于标记的氨基,羟基,羰基等基团,需要人为的引入可以标记的基团才可以进行 偶联反应。虽然有一些研究人员使用生物素化抗体-亲和素-生物素化DNA系统,但综合 考虑检测步骤繁琐程度、检测周期长短、检测重复性和准确性,可以采用本发明的共价交联 直接标记的方法。本发明采用含有琥珀酰亚胺基团和马来酰亚胺基团的异型双功能偶联剂 活化抗体上的氨基,并进一步和DNA片段上的巯基反应,形成DNA和抗体的复合物。得到的 DNA抗体复合物通过共价键偶联,抗体和DNA分子比例固定,可以用于免疫PCR等相应的实 验。
[0017] 实施例1 一种DNA标记抗体的方法
[0018] 1.将带马来酰亚胺基团和羟基琥珀酰亚胺基团的异双功能交联剂,例如: MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester),GMBS(Ν_ γ-Maleimidob utyryloxysuccinimide ester),EMCS (N- ( ε-Maleimidocaproyloxy)succinimide ester),SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), SMPB(Succinimidyl 4-(p_maleimidophenyl)butyrate)配制成溶液等。
[0019] 2.合成巯基修饰的寡核苷酸
[0020] 设计两条引物,
[0021] 一条巯基化修饰 PI :H0-C6-S-S-C6-P03-TTCTCATGTTTGACGCTT
[0022] 一条不用任何修饰 P2 :CGGAATGGACGATATCCCGC
[0023] 以pBR322质粒为模板,扩增200bp长度的片段,巯基化引物和普通引物以50:1的 比例加入到PCR体系中,不对称PCR扩增使扩增片段带上巯基修饰。
[0024]
[0025] 3.透析抗体和纯化寡核苷酸
[0026] 以PBS或者双蒸水透析抗体,以核酸纯化柱纯化PCR产物,最后用水溶解PCR产 物。
[0027] 4.偶联剂活化抗体
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