一种水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术和病毒检验领域，具体地涉及一种水泡性口炎病毒抗体 快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002] 水泡性口炎（Vesicularstomatitis,VS)是由弹状病毒科水泡病毒属的水泡性 口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV)引起的人畜共患的重大动物疫病。世界 动物卫生组织（0ΙΕ)将VS列为法定报告传染病。目前，VSV分为两个血清型，即印第安纳 (Indiana,IN型）和新泽西（NewJersey,NJ型）。VSV的感染谱很广，牛、猪、马、羊和其它 多种野生动物可感染，人也可以感染VSV，并出现急性热性类似流感的症状。动物感染VSV 发病后，临床症状与口蹄疫（FMD)症状非常相似，很难根据临床症状作鉴别诊断。水泡性口 炎严重影响反刍动物养殖业的健康发展及相关动物和动物产品的国际贸易，对疫区造成巨 大的经济损失。
[0003] VSV为单股负链RNA病毒，基因全长11163bp，共编码5种主要病毒蛋白，包括糖蛋 白（G)、基质蛋白（M)、核蛋白（N)、磷酸蛋白（NS)、病毒RNA聚合酶（L)。其中N蛋白由422 个氨基酸组成，呈现群特异性，为所有型的VSV所共有，诱导产生非中和抗体，与其它弹状 病毒无任何交叉反应，因此VSVN蛋白是作为建立VSV抗体免疫学检测方法的重要抗原。
[0004] 目前，可用于水泡性口炎病毒抗体检测的方法有琼脂扩散试验（AGID)和竞争 ELISA方法。由于琼脂扩散试验特异性较差，需要时间长等因素的制约，该方法在基层兽医 部门很少应用。竞争ELISA具有较好的特异性和敏感性，可用于实验室检测。但由于ELISA 检测需要专门的仪器设备和技术操作人员，在条件较好的实验室才可以得到应用。另外，目 前国内没有商品化的ELISA试剂盒。
[0005] 申请号为200910190437. 5的发明公开了 一种水泡性口炎病毒快速检测试纸 条及其制作方法，但其是检测水泡性口炎病毒，即检测抗原，准确性不高。申请号为 200410008749. 7的发明公开了一种水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体、表达抗原以 及制备方法，该发明使用的是水泡性口炎病毒N蛋白全基因，蛋白表达量并不高。申请号为 201010182429. 9的发明公开了一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法， 该发明虽是检测水泡性口炎病毒抗体，但使用抗原为VSV全病毒抗原，特异性较差。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明公开了一种水泡性口炎病毒重组N蛋白 抗原及其制作方法。
[0007] 本发明公开了一种水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其所述试纸条固定有水 泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 进一步地，所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
[0009] 所述试纸条包括背衬和硝酸纤维膜、金标复合物垫、样品垫、吸水垫，所述硝酸纤 维膜的上有检测线，所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原垫是固定在检测线上。
[0010] 进一步地，所述检测线，水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的包被量为0. 175μg/ 条。
[0011] 进一步地，所述硝酸纤维膜上还点有兔抗链球菌G蛋白IgG作为对照线。
[0012] 进一步地，所述对照线，兔抗链球菌G蛋白IgG的包被量为0. 35μg/条。
[0013] 进一步地，所述对照线与检测线之间距离为5mm。
[0014] 进一步地，所述试纸条为经过切条机加工成70_X 3. 5mm的成品。
[0015] 本发明针对水泡性口炎水泡性口炎病毒N蛋白氨基酸序列，通过抗原表位分析和 密码子优化获得截短并优化后的VSVN基因序列，通过人工合成该序列并在原核表达体系 表达该基因，获得水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原。相对于先有技术，本发明的水泡性口炎 病毒重组N蛋白抗原具有更好的抗原特性，且优化后的基因序列在表达体系中蛋白表达量 尚，效果好。
[0016] 将本发明的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病 毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本 较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手 段。
[0017] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【附图说明】
[0018] 图1为SDS-PAGE (左图）和Western-blot (右图）分析基因表达的VSVN蛋白。其 中，Μ :蛋白分子量标准；1 :转化pET52/LIC质粒的对照菌；2,4 :转化pET52/LIC-mVSVN质粒 的阳性菌（含密码子优化后的VSVN基因序列）；3, 5 :转化pET52/LIC-VSVN质粒的阳性菌 (含密码子未优化后的VSVN基因序列）。
[0019] 图2为水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条结构示意图。其中，
[0020] 1 :背衬，2 :硝酸纤维素膜，3 :样品垫，4 :金标复合物垫，5 :吸水垫，6 :检测线，7 : 对照线。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022] 实施例1 :截短的VSVN蛋白的表达
[0023] 1、VSVN蛋白抗原表位分析和密码子优化：通过检索NCBI数据库中VSVN基因序列 和对应氨基酸序列（GenBank:J02428. 1)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，确定 选择抗原表位位于N蛋白中第88~374位氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNo. 1， 其对应的核苷酸序列（GenBank:J02428. 1)为第325~1185nt位核苷酸，见序列表SEQID No. 5〇
[0024] 2、VSVN基因密码子优化和人工合成：密码子优化，即根据表达系统对氨基酸密码 子的偏爱性，对基因序列进行重新设计，将基因序列中利用率低或稀有的密码子修改为表 达系统使用频繁的密码子，确保所表达蛋白的氨基酸序列不变。根据大肠杆菌对密码子的 偏爱性，对选取的蛋白质片段对应的基因序列密码子进行优化，优化后的基因序列标记为 mVSVN，其序列为序列表中SEQIDNo. 2,通过人工合成该序列，将该序列克隆至pMD-18T载 体中。
[0025] 3、mVSVN基因引物设计：根据密码子优化后的VSVN基因序列，设计特异性引物，在 引物5'端人工添加LIC粘性末端，与商品化线性pET52/LIC末端互补的序列。PCR引物序 列如下，下划线部分为LIC粘性末端：
[0026] 上游引物（PI) ：5' ~CAGGGACCCGGTTGGTCAAGTTTCGGAATC~3,(SEQIDNo. 3)；
[0027] 下游引物（P2) :5,-GGCACCAGAGCGTTATCACGACCTTGTGGTGG-3'（SEQIDNo. 4);
[0028] 4、PCR扩增mVSVN基因：用PCR扩增试剂盒（Takara公司产品），从pMD-18T-mVSVN 质粒中扩增目的基因片段。在PCR管中加入以下组分：
[0029]
[0030] 将上述组分混合后置于PCR仪中，进行扩增。反应程序为95°C预变性5min;95°C lmin，55°Clmin，72°Clmin，35个循环，72°ClOmin。经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产 物约为890bp，用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物。
[0031] 5、pET52/LIC-mVSVN重组表达载体的构建：用T4DNA聚合酶处理的上述PCR产物 与商品化线性pET52/LIc载体（Invitrogen公司产品）连接，利用T4DNA聚合酶外切酶活 性，切去3'端约11~12个碱基，即形成与LIC位点序列互补的粘性末端，处理后的PCR产 物可与线性PET52/LIC定向连接。反应体系如下：
[0032]
[0033] 将上述反应物混合后，于22°C反应30min，然后于75°C反应20min。在1. 5mL离心 管中，加入线性PET52/LIC质粒1μL、经T4DNA聚合酶处理的PCR产物2μL和25mmol/L EDTAlyL，混合后，于22°C反应5min。取上述反应物lyL转化100yLNovaBlueE.coli 感受态细胞（Invitrogen公司产品），冰浴5min，42°C热激30s，冰浴2min。加入300μL S0C液体培养基，37°C震荡（200r/min)培养lh后，5,000r/min离心5min，弃去350yL上 清，用加样器吹打数次，重悬菌体后涂布含Ampicillin(50μg/mL)的LB平板上，37°C培养 16h后，随机挑取6个单菌落，分别接种至3mL含Ampicillin(50μg/mL)的LB培养液中， 37°C震荡培养过夜。取1. 5mL培养物，用质粒DNA提取试剂盒（TARAKA公司产品）提取质 粒DNA，用该DNA作为模板，进行PCR鉴定。PCR反应体系如下：
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[0035] 反应程序为：95°C预变性 5min;95°Clmin，54°Clmin，72°Clmin，30 个循环， 72°C10min。PCR反应结束后，取8yLPCR产物进行电泳分析。同时将pET52/LIC-mVSVN 质粒DNA送到TAKARA公司进行DNA序列测定，经测定，其序列为序列表中SEQIDNo. 2完 全一致。
[0036] 6、VSVN蛋白在原核细胞中的表达及分析：将上述经鉴定的pET52-VSVN质粒DNA 转化（DE3)pLacIE.coli感受态细胞（Invitrogen公司产品），涂于含Ampicillin(50μg/ mL)的LB固体培养基，37°C培养12~16h，挑取阳性单菌落，接种于5mLLB培养基，于37°C 震荡培养2h后，加入IPTG(终浓度为lmmol/L)进行诱导表达VSVN蛋白。收集上述菌液， 5000r/min离心10min，取上清，加入原体积约1/10的PBS(pH7. 2)，用超声波破碎仪对菌体 进行破碎处理。经SDS-PAGE分析，表达产物大小约为36Ku(图1)。由图1可看出SDS-PAGE 试验表明经过优化后，VSVN蛋白表达量明显提高。用羊抗VSV阳性血清和HRP标记的兔抗 羊IgG(SIGMA公司产品）进行Westernblot分析，结果表明表达产物可以和抗VSV阳性血 清反应。
[0037] 7、VSVN蛋白的纯化：使用6XHis标签融合蛋白纯化试剂盒对表达VSVN表达产物 进行纯