检测血清样品中抗药物抗体的干扰抑制性免疫测定的制作方法
【专利说明】检测血清样品中抗药物抗体的干扰抑制性免疫测定
[0001] 本文中报道了检测来自用抗炎症抗体治疗的患者的血清样品中抗药物抗体的干 扰抑制性免疫测定及其用途。
[0002] 发明背景
[0003] 新治疗性抗体的临床开发需要通过适宜的测定评价其潜在免疫原性 (Kaliyaperumal,A.和Jing,S.，Curr.Pharm.Biotechnol. 10 (2009) 352-358)。抗药物抗体 (ADA)检验通常涉及双滴度方案：（1)用于ADA检测的测定和（2)用于表征ADA的测定。ADA 检测测定包括筛查和特异性验证（验证性）测定。基于微量滴定板的酶联免疫吸附测定 (ELISA)仍然是筛查ADA的最广泛使用样式，原因在于其高通量效率、相对简单和高灵敏度 (Geng,D.等人，J.Pharm.Biomed.Anal. 39 (2005) 364-375)。ADAELISA最经常以提供高度 选择性、检测全部同种型和泛物种ADA检测能力的桥样式设计（Mire-Sluis,A.R.等人，J. Immunol.Methods289(2004) 1-16)。
[0004] 已经开发桥接ELSA并且用作抗IL6R抗体托珠单抗（tocilizumab)的筛查和验证 ADA测定（Stubenrauch,K.等人，Clin.Ther. 32 (2010) 1597-1609) 〇
[0005] Stubenrauch,K.等人报告了用于来自暴露于人抗体的小鼠的血清样品中药物 耐受性的一般抗药物抗体测定（Anal.Biochem. 430 (2012) 193-199)。Bourdage,J.S.等 人报道双抗原桥接免疫测定样式对抗原包被浓度依赖性的影响和设计用于单克隆抗体 的免疫原性测定的意义（J.Pharm.Biochem.Anal. 39 (2005)685-690)。Mikulskis，A.等 人报道了溶液ELISA作为开发稳健、药物耐受性免疫原性测定支持药物开发的选择平台 (J.Immunol.Meth. 365 (2010) 38-49)。Pan,J.等人报道在两种生物治疗药的免疫原性检验 中 快速测定与ELISA方法的比较（J.Pharm.Tox.Meth. 63 (2010) 150-159) 〇
[0006] 在TO2009/077127中，报道了区分性测定。
[0007] Qiu，Z.J.等人报道了用于检测自身免疫血清中人抗治疗性抗体的基于生物 素-洋地黄毒甙的新型均相测定（J.Immunol.Meth. 362 (2010) 101-111)。
[0008] 发明简沐
[0009] 本文中报道了桥接酶联免疫吸附测定（桥接ELISA)，所述测定可以用作为筛查、 验证和跟踪测定用于检测以治疗性抗体治疗的患者的含有血清的样品中的抗药物抗体 (ADA)。如果含有血清的样品来自患有自身免疫疾病（如类风湿性关节炎（RA))的患者，则 如本文中报道的测定特别有用。
[0010] 如本文中报道的测定显示在待分析样品中治疗性抗体的量方面改进的耐受性 (ADAELISA的药物耐受性增加）并且同时假阳性测定结果的数目减少。
[0011] 已经发现采用如本文中报道的测定时，由游离药物和由类风湿因子（RF)所致的 干扰可以最小化。
[0012] 如果样品含有非所讨论的抗药物抗体的、能够在免疫测定中干扰抗药物抗体的检 测并且，因此，将导致假阳性免疫测定结果的抗体，则这种测定特别有用。
[0013] 在一个实施方案中，如本文中报道的方法用于测定用于抗炎疗法的药物抗体的抗 药物抗体。
[0014] 通过以下方面的协同性相互作用实现增加的药物耐受性：1)增加生物素化的和 洋地黄毒甙化的捕获和示踪试剂的浓度；2)同时，而不是顺序孵育血清样品与捕获和示踪 试剂；3)延长的孵育时间；4)使用均匀单偶联的捕获和示踪试剂；和5)使用增加的血清基 质含量。
[0015] 可以通过添加寡聚人免疫球蛋白G(IgG)作为添加物，抑制来自类风湿因子的干 扰。
[0016] 如本文中报道的干扰抑制性ADA测定的药物耐受性高于本领域已知的测定至少 10倍。
[0017] 如本文中报道的一个方面是包含捕获药物抗体和示踪药物抗体的用于检测样品 中针对药物抗体的抗药物抗体的酶联免疫吸附测定，其中
[0018] a)捕获药物抗体和示踪药物抗体以多于0.5μg/ml的浓度使用，
[0019] b)将样品同时与捕获药物抗体和示踪药物抗体孵育4至24小时，
[0020] c)将捕获药物抗体和示踪药物抗体经由单个赖氨酸残基衍生，
[0021] d)样品包含7. 5%或更多的血清，和
[0022] e)用捕获药物抗体和示踪药物抗体孵育之前，向样品添加寡聚人IgG。
[0023] 如本文中报道的一个方面是包含捕获药物抗体和示踪药物抗体的用于检测类风 湿性关节炎患者的样品中针对药物抗体的抗药物抗体的酶联免疫吸附测定，其中
[0024] a)在酶联免疫吸附测定中捕获药物抗体和示踪药物抗体具有0.5μg/ml或更大 的浓度，
[0025] b)将样品同时与捕获药物抗体和示踪药物抗体孵育0. 5至24小时，
[0026] c)捕获药物抗体是捕获药物抗体和特异性结合对的第一组分的1:1缀合物并且 示踪药物抗体是示踪药物抗体和可检测标记物的1:1缀合物，
[0027] d)样品包含1 %或更多的血清，和
[0028] e)用捕获药物抗体和示踪药物抗体孵育之前，向样品添加寡聚人IgG。
[0029] 在一个实施方案中，样品包含5%或更多的血清。在一个实施方案中，样品包含 7. 5%或更多的血清。
[0030] 在一个实施方案中，样品包含抗药物抗体和类风湿因子。
[0031] 在一个实施方案中，药物抗体是治疗炎性疾病的抗体。在一个实施方案中，治疗炎 性疾病的抗体是治疗自身免疫疾病的抗体。在一个实施方案中，自身免疫疾病是类风湿性 关节炎或青少年关节炎或骨关节炎或Castleman病。
[0032] 在一个实施方案中，药物抗体是治疗癌症的抗体。在一个实施方案中，抗体用于治 疗骨髓瘤或浆细胞瘤。
[0033]在一个实施方案中，药物抗体是针对IL-6受体的抗体（抗IL6R抗体）、或针对 IGF-1受体的抗体（抗IGF1R抗体）、或针对IL-13受体1α的抗体（抗IL13R1α抗体）、 或针对0x40L的抗体（抗0x40L抗体）、或针对肿瘤坏死因子α的抗体（抗TNFα抗体）。 在一个实施方案中，药物抗体是抗IL6R抗体。在一个实施方案中，抗IL6R抗体是托珠单抗。 [0034] 在一个实施方案中，捕获药物抗体缀合至固相。在一个实施方案中，捕获药物抗 体缀合至固相是经由特异性结合对实施的。在一个实施方案中，特异性结合对（第一组 分/第二组分）选自链霉亲和素或抗生物素蛋白/生物素、或抗体/抗原（参见，例如， Hermanson,G.T.等人，BioconjugateTechniques,AcademicPress, 1996)、或凝集素 / 多 糖、或类固醇/类固醇结合蛋白、或激素/激素受体、或酶/底物、或IgG/蛋白A和/或蛋 白G。
[0035] 在一个实施方案中，捕获药物抗体缀合至生物素（作为特异性结合对的第一组 分）。在这种情况下，经由固定化的抗生物素蛋白或链霉亲和素实施缀合至固相。
[0036] 在一个实施方案中，示踪药物抗体缀合至可检测标记物。在一个实施方案中，示踪 药物抗体经由特异性结合对缀合至可检测标记物。在一个实施方案中，特异性结合对（第 一组分/第二组分）选自链霉亲和素或抗生物素蛋白/生物素、或抗体/抗原（参见，例如， Hermanson,G.T.等人，BioconjugateTechniques,AcademicPress, 1996)、或凝集素 / 多 糖、或类固醇/类固醇结合蛋白、或激素/激素受体、或酶/底物、或IgG/蛋白A和/或蛋 白G。
[0037] 在一个实施方案中，示踪药物抗体缀合至洋地黄毒甙（作为可检测标记物）。在这 种情况下，经由针对洋地黄毒甙的抗体实施连接至可检测标记物。
[0038] 在一个实施方案中，捕获药物抗体和示踪药物抗体在酶联免疫吸附测定（ELISA) 中具有约〇. 5μg/ml至约10μg/ml的浓度。在一个实施方案中，捕获药物抗体和示踪药物 抗体具有多于〇. 5μg/ml至小于10μg/ml的浓度。在一个实施方案中，捕获药物抗体和示 踪药物抗体具有约1μg/ml至约5μg/ml的浓度。在一个实施方案中，捕获药物抗体和示 踪药物抗体具有约1. 4μg/ml至约1. 8μg/ml的浓度。在一个实施方案中，捕获药物抗体 和示踪药物抗体具有约1. 45μg/ml至约1. 6μg/ml的浓度。在一个优选的实施方案中，捕 获药物抗体和示踪药物抗体具有约1. 5μg/ml的浓度。
[0039] 在一个实施方案中，孵育时间是至少6小时。在一个实施方案中，孵育时间是至少 12小时。在一个实施方案中，孵育时间是至少16小时。
[0040] 在一个实施方案中，孵育时间是最多24小时。
[0041] 在一个实施方案中，孵育时间在4小时和24小时之间。在一个实施方案中，孵育 时间在6小时和24小时之间。在一个实施方案中，孵育时间在12小时和24小时之间。在 一个优选的实施方案中，孵育时间在12小时和20小时之间。在一个实施方案中，孵育时间 在14小时和18小时之间。在一个实施方案中，孵育时间是约16小时。
[0042] 在一个实施方案中，样品包含1%至20%的血清。在一个实施方案中，样品包含约 10 %的血清。
[0043] 在一个实施方案中，将寡聚人IgG添加至终浓度10μg/mL至1000μg/mL。在一个 实施方案中，将寡聚人IgG添加至终浓度15μg/mL至500μg/mL。在一个实施方案中，将寡 聚人IgG添加至终浓度20μg/mL至250μg/mL。在一个实施方案中，将寡聚人IgG添加至 终浓度25μg/mL至100μg/mL。在一个优选的实施方案中，将寡聚人IgG添加至终浓度约 50μg/mL〇
[0044] 如本文中报道的一个方面是包含捕获药物抗体和示踪药物抗体的用于检测类风 湿性关节炎患者的样品中针对药物抗体的抗药物抗体的酶联免疫吸附测定，其中
[0045] a)在酶联免疫吸附测定中捕获药物抗体和示踪药物抗体具有约1. 5μg/ml的浓 度，
[0046] b)将样品同时与捕获药物抗体和示踪药物抗体孵育14至16小时，
[0047] c)捕获药物抗体是经由捕获药物抗体的赖氨酸残基的捕获药物抗体和生物素的 1:1缀合物并且示踪药物抗体是经由示踪药物抗体的赖氨酸残基的示踪药物抗体和洋地黄 毒甙的1:1缀合物，
[0048] d)样品包含1 %至20%的血清，并且
[0049] e)用捕获药物抗体和示踪药物抗体孵育之前，向样品添加寡聚人IgG至终浓度 25μg/mL至 100μg/mL，
[0050] 如本文中报道的一个方面是寡聚人IgG在抗药物抗体ELISA中捕获类风湿因子的 用途。
[0051 ] 如本文中报道的一个方面是治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体 施用有效量的治疗性抗体（药物）并且用如本文中报道的测定确定抗药物抗体的存在。
[0052] 如本文中报道的一个方面是治疗患有炎性疾病的个体的方法，所述方法包括向该 个体施用有效量的抗IL6R抗体（药物）并且用如本文中报道的测定确定抗-抗IL6R抗体 的抗体（抗药物抗体）的存在。
[0053] 在一个实施方案中，炎性疾病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，自身免疫疾病 选自类风湿性关节炎、青少年关节炎、骨关节炎或Castleman病。
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