检测内分泌干扰化合物的制作方法
【专利说明】检测内分泌干扰化合物
[0001] 本发明涉及检测内分泌干扰化合物。特别地，本发明涉及用于检测内分泌干扰化 合物的检测装置以及检测内分泌干扰化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 众所周知，在环境中的某些激素活性剂可通过发送错误信号或阻断正当信号来干 扰内分泌系统的化学信使（激素）。公认的激素活性剂，也称为内分泌干扰化合物（EDC)， 通过模拟、阻断和干扰激素的生理功能在人和野生动物上发挥其有害作用。美国内分泌学 会在2009年做出了综合报告，提出的证据表明，内分泌干扰物影响雄性和雌性生殖、乳腺 发育和癌症、前列腺癌、神经内分泌学、甲状腺活动、新陈代谢、肥胖症和心血管内分泌学 (Diamanti-Kandarakis等，2009)。由动物模型、人临床观察以及流行病研究得出的报告结 论提供的大量证据表明，EDC对公众健康造成显著影响。
[0003] 激素通过在靶细胞中与其相应的受体相互作用以触发应答和促进正常的生物学 功能例如生长、发育、行为和生殖来发挥其功能。激素活性的干扰，例如在使用H)C的情况 下，可导致可逆或不可逆的异常生物学结果，包括发育障碍、短期记忆损伤、输卵管妊娠、少 精子症、生殖障碍和免疫系统损害。清楚的是，随着研究人员继续观察由这些有害化合物在 人和野生动物上引起的负面影响，他们继续发现其在非常低剂量下的显著、通常持久的作 用。
[0004] 内分泌干扰化合物可分为三个主要的类别：雄激素的（模拟或阻断天然睾酮的化 合物）、甲状腺性（对甲状腺具有直接或间接影响的化合物）以及雌激素的（模拟或阻断天 然雌激素的化合物）。虽然EDC的谱很广，但是雌激素化合物（EC)是这些类别的化合物中最 突出的和最受研究的。这于所有的可能性是由于EC在癌症研究中的重要性，特别是关于雌 性性发育和素乱（McLachlan等，2006;DarbreandCharles, 2010 ;Fenton, 2006;Newbold 等，2007)。在数以千计的产品中发现了低剂量的雌激素化合物，包括化合物如己烯雌酚、双 酚A、多溴联苯醚和邻苯二甲酸盐。雄激素EDC也受到大量关注，是由于其在男性征和生育 力上的作用（Bay,Asklund等，2006 ;Sharpe, 2006;Skakkebak等，2001)。据广泛报道，内 分泌干扰化合物以非常低的浓度存在于环境中，但是其相对高的脂溶性导致这些物质在食 物链较高端的有机体和动物的脂肪沉着体中生物积累，导致在这些相对低浓度下的显著生 理学响应。在杀虫剂、除草剂、杀真菌剂、增塑剂、塑料、树脂以及工业化学品例如去污剂中 发现了另一些相关来源的EDC(Diamanti-Kandarakis等，2009)。EDC的疏水性连同其他化 学性质已经对环境分析化学家在开发用于检测和筛查其所需的技术方面产生了独有的挑 战。已经使用了数种分析技术。这些方法通常包括固相萃取（SPE)，然后是：高效液相色谱 法（HPLC)、液相色谱/质谱法（LC/MS)或气相色谱/质谱法（GC/MS)。然而，这些技术对于 一般的EDC监测是有限的，因为相对高的仪器成本、密集的劳动以及在一些情况下相对低 的灵敏度。此外，高端分析步骤通常仅特异于一种单一的分析物或者有限类别的结构上相 关的化合物。
[0005] 亲和色谱法（AC)是强大的色谱技术，其利用生物分子与配体（激素受体 与激素）之间的特异性相互作用来影响配体或底物类似物的特异性结合和分离 (Cuatrecasas, 1970)。在AC过程中，将生物特异性和可逆相互作用用于从复杂生物基质 中选择性分离和纯化生物分子。这些系统愈来愈多应用于生物技术领域，因为这些技术具 有从复杂混合物中特异性结合和移除生物分子的能力。典型的亲和系统由两个不同部分 组成：流动相以及固定相，流动相携带待分离的生物分子，固定相通常被改性为携带亲和配 体。虽然事实上这些系统被广泛使用，但是其仍然具有一些缺点，包括需要大的柱装配和较 长的扩散路径长度，这反过来导致从引入粗提取物到最终纯化的产品的整个下游处理所需 的时间显著增加。膜亲和色谱法（MAC)被引入来克服柱亲和色谱法的主要缺点。膜亲和色 谱法的引入已经显著地减少了获得纯产品所需的步骤数量，因为固定相与靶生物分子之间 的特异性相互作用，加之系统所提供的较大表面积和较短扩散路径长度。由于上文提及的 优点，亲和膜系统（AMS)可用作分析检测的有力方法，以及从环境中移除EDC的可能移除方 法。
[0006] 雌激素化合物是通过在内分泌系统中与雌激素受体（ER)的配体结合结构域 (hERaLBD)结合来模拟或阻断内源性雌激素活性的一类EDC。可利用雌激素与其受体之间 的相互作用并使用从该相互作用中获得的化学信息来开发用于EC的初始捕获、浓缩和定 性检测的更加可靠和特异性的分析功能化亲和膜系统。这种方法将是补充性的并与用于检 测环境中的EC的高技术分析技术例如HPLC、GC/MS和LC/MS-同使用。还可将类似的系统 用于使用hARLBD的雄激素EDC。
[0007] 发明人确定了新的检测装置，其在监测和检测内分泌干扰化合物方面是快速且高 效的。
[0008] 在本说明书中提及的术语"性激素受体"特异性地是指雌激素受体和雄激素受体。
[0009] 在本说明书中，将使用以下缩写：
[0010] 3HE2 2,4,6,7? 17β-雌二醇
[0011] AC 亲和色谱法
[0012] AMS 亲和膜系统
[0013] AR 雄激素受体
[0014] CA 醋酸纤维素
[0015] CPM 计数/分钟
[0016] DMDD0 二羧甲基_3, 6-二氮杂辛烷二酸盐
[0017] DMF 二甲基甲酰胺
[0018] DMS0 二甲基亚砜
[0019] E2 17β-雌二醇
[0020] EC 雌激素化合物
[0021] EDC 内分泌干扰化合物
[0022] EDTA 乙二胺四乙酸
[0023] ELISA 酶联免疫吸附试验
[0024] ELRA 酶联受体试验
[0025] ER 雌激素受体
[0026] ERE 雌激素应答元件
[0027] FT-IR傅里叶变换红外光谱法
[0028] GC气相色谱法
[0029] GC/MS气相色谱/质谱法
[0030] HF中空纤维
[0031] HFF中空细纤维
[0032] his6六组氨酸
[0033] HPLC高效液相色谱法
[0034] HRP辣根过氧化物酶
[0035] IMAC固定化金属离子亲和色谱法
[0036] LBD配体结合结构域
[0037] LC/MS液相色谱/质谱法
[0038] LLD最低检测限
[0039] MAC膜亲和色谱法
[0040] MBP麦芽糖结合蛋白
[0041] MS质谱法
[0042] NMR核磁共振
[0043] PCR聚合酶链式反应
[0044] PDMDDOPluronic_/N，N-二羧甲基_3, 6_二氮杂辛烷二酸盐
[0045] PEI聚醚酰亚胺
[0046] PIXES质子诱导X-射线发射光谱法
[0047] PS聚苯乙烯
[0048] PSU聚砜
[0049] PVDF聚偏二氟乙烯
[0050] SDSPAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0051] SEM扫描电子显微镜
[0052] SPE固相萃取
[0053] UF 超滤
[0054] 在本说明书中参考以下文件：
[0055] BAY,K. ,ASKLUND,C. ,SKAKKEBAEK,N.E.andANDERSS0N，Α，Μ·，2006. Testiculardysgenesissyndromepossibleroleofendocrinedisrupters.Best Practice&ResearchinClinicalEndocnnology&Metabolism，20 (1)，77-90.
[0056] CUATRECASAS?P. ?1970.Proteinpurificationbyaffinitychromatography. JournalofBiologicalChemistry，245(12)，3059-3065.
[0057] DARBRE，P.D.andCHARLES，A.K.，2010.Environmentaloestrogensandbreast cancer：evidenceforcombinedinvolvementofdietary，householdandcosmetic xenoestrogens.AnticancerResearch，30(3)，815-827.
[0058] DIAMANTI-KANDARAKIS，E.，B0URG