从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。
【背景技术】
[0002]外泌体(Exosome)是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在体液如血清、血楽、尿液中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，因此提取细胞外的外泌体用于疾病、肿瘤等的诊断、监控有巨大的应用潜能。
[0003]目前，外泌体提取的研究主要集中在细胞、血清样本中提取外泌体，其主要采取的提取方法有:超高速离心法、过滤离心法、密度梯度超高速离心法、免疫磁珠结合超高速离心法、色谱法。这些方法各有缺点，例如，超高速离心法以及免疫磁珠结合超高速离心法均需要采取lOOOOOg及以上的超高速离心，对设备要求高，提取成本昂贵；再例如，超高速离心法和过滤离心法均存在纯度不高的问题；密度梯度离心法虽然纯度高但其步骤繁杂、耗时、量少；色谱法需要特殊的设备，应用不广泛。此外，无论是从细胞还是血清样本中提取外泌体，在样本收集中都不可避免地会对患者进行创伤性操作，以获取血液或细胞，并且，为了满足后续检测的实验要求，有时候需要收集大量的样本，因此，类似的有创提取方式在临床应用上存在很大的局限性。所以，尤其需要发展一种能够可靠、快速、经济地无创分离提取外泌体尤其是肿瘤来源的外泌体的方法。
[0004]外泌体在尿液中能稳定存在，而且，尿液样品容易大量获得并能避免创伤性损伤，因此，如果能够检测尿液外泌体中的肿瘤信息，则有望将其用于肿瘤的无创诊断、监控等应用。但是，实际上，由于单位体积尿液中的外泌体含量非常低，采用一般方法单次提取得到的外泌体，根本无法满足后续检测测序的要求，因此，鲜少有文献报道尿液中外泌体的提取方法。在现有的为数极少的提取尿液中外泌体的相关文献中，均明显存在不少问题而导致无法临床应用。例如:题为“Isolat1n and Purificat1n of Exosomes in Urine”的文章(Gonzales PA等，Methods Mol B1l.2010 ;641:89-99)中公开了两种从尿液中分离外泌体的方法，采用超速离心或超滤管的方法提取了外泌体，其中，超速离心的方法，污染杂质较多，操作也非常繁琐，还需要配置超高速离心机，临床应用推广困难；而借助超滤管的方法，虽然能避免超高速离心机的使用，但是避免不了其他蛋白聚集或大分子蛋白复合体等的残留，对后续针对exosome的实验研究也会带来错误信息。此外，尿液中的外泌体来源非常复杂，无法评估其中属于肿瘤细胞分泌的外泌体。基于以上的限制，目前尚未有文献公开报道从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，能够从肿瘤患者的尿液中获得高量、特异性高且能直接用于后续的流式技术检测的肿瘤细胞来源的外泌体。
[0006]—种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤:
[0007](1)将尿液样本收集于第一离心管中，2?8°C、300?500g离心10?15分钟，分离得到上层液体；
[0008](2)将所述上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀；
[0009](3)用缓冲液将所述沉淀进行重悬，得到第一重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7?8 ;将所述第一重悬液在2?8°C、10000?12000g离心30?40分钟，分离得到上清液；
[0010](4)将所述上清液与总外泌体抽提液以2:1的体积比在第二离心管混合，震荡均匀后，2?8°C孵育6?16小时，然后，将孵育后的混合液在2?8°C、10000?12000g离心60?80分钟，移除上层清液后，在所述第二离心管的底部得到固相物质，为尿液总外泌体；
[0011](5)用缓冲液将所述尿液总外泌体进行重悬，得到第二重悬液，为尿液总外泌体的重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7?8 ;
[0012](6)将所述第二重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子(Epithelial celladhes1n molecule, EpCAM)抗体标记磁珠的第三离心管中，2?8°C孵育6?16小时；
[0013](7)将所述第三离心管置于磁力架，吸附2?10分钟，移除管内液体，这样在所述第三离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
[0014]本发明中，步骤(3)和步骤(5)中，所述的缓冲液可以相同，也可以不同。优选步骤(3)和步骤(5)中均为磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，最优选为IX磷酸盐缓冲液。
[0015]本发明中，在步骤(7)之后，还可以向所述第三离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7?8，然后将所述第三离心管置于磁力架吸附2?10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。优选重复该清洗步骤2?3次。优选所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，最优选为IX磷酸盐缓冲液。
[0016]采用上述的本发明方法，只需要患者一次取样的常规量(10?100ml)的尿液样本，即可提取到能够用于后续检测测序的足够量的肿瘤细胞来源的外泌体。本发明中，优选尿液样本的体积为25?50ml。
[0017]采用本发明的上述方法，尿液样本经一次离心分离后进行冻干处理得到沉淀，使用缓冲液对所得沉淀进行重悬时，优选所述缓冲液的体积为0.5?2.5ml，以不超过1ml为最佳。在最佳的条件下，第一重悬液经离心分离得到的上清液的体积不超过1ml，而所用总外泌体抽提液的体积不超过0.5ml，这样，所用总外泌体抽提液的成本不超过40元。
[0018]因此，本发明还提供了以下优选的技术方案:
[0019]—种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤:
[0020](1)将25?50ml尿液样本收集于第一离心管中，4°C、300?500g离心10?15分钟，分离得到上层液体；
[0021 ] (2)将所述上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀；
[0022](3)用0.5?2.5ml缓冲液将所述沉淀进行重悬，得到第一重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7?8 ;将所述第一重悬液在4°C、10000?12000g离心30?40分钟，分离得到上清液；
[0023](4)将所述上清液与总外泌体抽提液以2:1的体积比在第二离心管混合，震荡均匀后，4°C孵育6?16小时，然后，将孵育后的混合液在4。。、10000?12000g离心60?80分钟，移除上层清液后，在所述第二离心管的底部得到固相物质，为尿液总外泌体；
[0024](5)用0.5?2.5ml缓冲液将所述尿液总外泌体进行重悬，得到第二重悬液，为尿液总外泌体的重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7?8 ;
[0025](6)将所述第二重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第三离心管中，4°C孵育6?16小时；
[0026](7)将所述第三离心管置于磁力架，吸附2?10分钟，移除管内液体，这样在所述第三离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
[0027]同样，在优选的技术方案中，步骤(3)和步骤(5)中，所述的缓冲液可以相同，也可以不同。进一步优选步骤(3)和步骤(5)中均为磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferedSaline，PBS)，最优选为1 X磷酸盐缓冲液。
[0028]同样，在更优选的技术方案中，在步骤(7)之后，还可以向所述第三离心管中加入
0.5?2.5ml缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7?8，然后将所述第三离心管置于磁力架吸附2?10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。该清洗步骤可以重复2?3次。优选所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，最优选为IX磷酸盐缓冲液。
[0029]在更优选的技术方案中，步骤⑴中，所述离心时间为10分钟。
[0030]在更优选的技术方案中，步骤(3)中，所述离心时间为30分钟。
[0031]在更优选的技术方案中，步骤⑷中，所述离心时间为60分钟。
[0032]在更优选的技术方案中，步骤(7)中，所述吸附时间为5分钟。
[0033]本发明中，所述的总外泌体抽提液可以采用现有技术中常用的市售总外泌体抽提液，例如:Exosome Isolat1n kit (Life Technologies)、Exoquick (System B1science)、Exo-spin (Cell Guidance System)等；优选 Invitrogen 公司生产的 Total ExosomeIsolat1n，可由市场购得。
[0034]本发明中，所述的上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠可以通过商业途径购买得到，例如:Exosome-Human EpCAM Isolat1n Reagent (Invitrogen)、CD326 (EpCAM)MicroBeads (Miltenyi B1tec)、EasySep? Human EpCAM Positive Select1nKit (StemCell);优选 Invitrogen 公司生产的 EpCAM beads。
[0035]本发明中，所述的尿液样本为肿瘤患者的尿液样本。