抗cxcl1、cxcl7和cxcl8抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及预防和治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的领域，尤其是 病理性血管生成性疾病的领域。
[0002] 具体地，本发明涉及针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体，以及它们的应 用，特别是用作药物用于治疗和/或预防趋化因子CXCLUCXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其 是病理性血管生成性疾病。
【背景技术】
[0003] 在20世纪70年代早期，Judah Folkman提出靶向血管生成来治疗癌症。许多临 床前研究和临床研究证实了这种最初的假设，并且导致许多治疗性化合物的开发，包括人 源化的单克隆抗体和大量激酶抑制剂。
[0004] 血管生成最重要的因子之一是VEGF(血管内皮生长因子）。几乎在VEGF发现的 20年后，贝伐单抗（Hurwitz等人，2004)( -种革巴向VEGF的人源化单克隆抗体）才得到了 食品与药物监督管理局（FDA)的批准，联合标准的化疗剂伊立替康用于治疗结肠癌。
[0005] 也已经开发了其它许多抗血管生成的化合物，包括酪氨酸激酶受体抑制剂，如苹 果酸舒尼替尼（Choueiri等人，2008)和索拉非尼甲苯磺酸盐（酯）（Eisen等人，2008)，还 有细胞内激酶的抑制剂，如坦西莫司（Motzer等人，2008)和非受体丝氨酸苏氨酸激酶抑制 剂。
[0006] 尽管采用这些疗法使得无进展生存显著增加，仍观察到了不可避免的复发和疾病 发展成为死亡。一些最近的论文描述了一种称作治疗逃逸（treatment evasion)的新现 象，以及在使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的情况下选择具有增加转移潜能的更加侵袭性 的细胞（Ebos 等人，2009, Paez-Ribes 等人，2009) 〇
[0007] 以这种方式，靶向VEGF用于RCC抗血管生成疗法；然而，单独靶向VEGF仅仅有一 部分取得成功。尽管使用VEGF的中和性人源化抗体（即贝伐单抗）显著增加了无进展生 存（Yang 等人，2003) (Escudier 等人，NEJM 2007)，2009 年 ASCO 会议上提出的关键 AVOREN 研究中报道在安慰剂和贝伐单抗治疗的患者之间没有显著差异（Escudier等人，2010)。不 同的机制都可能引起治疗逃逸，包括血管生成冗余、或者由于存在VEGF的抗血管生成形式 (称为VEGFxxxb)而导致的无疗效（inefficacy)，该VEGF的抗血管生成形式是VEGF前mRNA 的选择性剪接所导致的（Harper, 2008)。
[0008] WO 2008/130969公开了通过将所述五种抗原的混合物注射至小鼠而得到的单克 隆抗体，所述抗体能够结合五种抗原：人IL_8(CXCL8)、Gro-a (CXCLl)、Gro-β (CXCL2)、 Gro- γ (CXCL3)和ENA-78 (CXCL5)，并公开了所述抗体在非人灵长类动物的吸入性LPS急性 肺部炎症模型中的用途。然而，WO 2008/130969没有披露结合CXCLUCXCL7和CXCL8的单 克隆抗体。
[0009] WO 2011/100271 公开 了能够结合人 IL-8(CXCL8)、Gro-a (CXCLl)、 Gro- β (CXCL2)、Gro- γ (CXCL3)、GCP2、ΝΑΡ2 (CXCL7)和 ENA-78 (CXCL5)的单克隆抗体。然 而，WO 2011/100271没有公开所述单克隆抗体针对所述抗原的亲和性。
[0010] 因此，本领域仍然明显需要新型的且改进的抗血管生成化合物，其增加患者寿命 并避免复发和疾病进展到死亡。通过本文所公开的本发明，本发明人向前迈出了显著的一 步。
[0011] 本发明的目的在于通过提供新型化合物来满足这种需要，所述的化合物使得能够 解决全部或部分上述问题。
[0012] 出乎意料地，本发明人证实他们新开发的针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的 抗体能够有效地抑制肿瘤的生长，特别是在RCC的小鼠模型中（透明细胞型肾细胞癌）。RCC 是用于研究抗血管生成疗法最相关的模型之一，因为RCC是高度血管化的肿瘤（由于von Hippel Lindau基因中的突变而产生）。
[0013] 这些结果是出乎意料的，因为最近的几篇论文描述抑制趋化因子（包括CXCL8)不 能抑制反而促进肿瘤生长。在这方面，Yao等人（2007)证明了 CXCL-8的抑制促进裸鼠体 内的肿瘤生长。
[0014] 令人惊奇的是，这些新开发的抗体能够比单独或组合使用的市售抗CXCLMA CXCL7和抗CXCL8抗体更有效地抑制肿瘤的生长。这些结果真是令人惊奇，因为本发明人 证明市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合（有或没有市售抗CXCLl抗体）对肿瘤生长的抑 制不能够获得加和的效果。与此相反，本发明人已经表明在肿瘤生长的抑制方面，市售抗 CXCL7和抗CXCL8抗体的组合使用没有单独使用它们时有效，并在RCC小鼠模型中具有促肿 瘤效应。
【发明内容】
[0015] 因此，在一方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其针对人趋化因子CXCL1、 CXCL7和CXCL8,正如通过表面等离子体共振所确定的，尤其是在25°C，更特别是根据实施 例中描述的Macore?等离子体共振分析，所述的抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解 离常数（K d)结合人趋化因子CXCLl、以至多5nM的平衡解离常数（Kd)结合人趋化因子CXCL7 以及以至多45nM的平衡解离常数（K d)结合人趋化因子CXCL8。
[0016] 可以通过用肽免疫动物（如大鼠）来获得本发明的抗体，其中所述 的肽是人CXCL7所特异的，但是和人CXCLl和8具有相似性，尤其是使用序列 SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQ ID N0:20)的肽免疫动物，随后通过筛选方法分离抗体。 可以使用不同的筛选方法来分离抗体，包括Bourcier等人描述的（2011)在偶联到钥孔血 蓝蛋白的所述肽上面进行的ELISA测试、以及在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的 ERK激活的抗体能力的测试。
[0017] 在一个具体的实施方式，本发明还涉及通过包括以下步骤的方法获得的或者易于 获得的抗体：
[0018] i)用至少一种肽免疫至少一种动物，其中所述肽是人CXCL7所特异的，但是与人 CXCLl 和 8 具有相似性，尤其是采用序列 SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQ ID N0:20)的 肽，
[0019] ii)通过本领域技术人员已知的任何方法产生单克隆抗体，比如从所述动物中分 离B细胞，并将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合形成能够分泌单克隆抗体的永生杂交瘤细胞，
[0020] iii)进行筛选方法来分离能够结合序列SEQ ID N° 20的肽的抗体、或者能够结 合偶联至钥孔血蓝蛋白的序列SEQ ID N° 20的肽的抗体、和/或能够在表达CXCR2的细胞 中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的抗体，特别是在Bourcier等人描述的分析中（2011)。
[0021] 根据本发明的抗体特别具有以下优点：
[0022] -它们是针对多个CXCL趋化因子的独特描述的抗体，特别是CXCLI、CXCL7和 CXCL8 ；
[0023] -相较于市售可获得的仅仅针对所述趋化因子之一的抗体而言，它们对每个趋化 因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的亲和性是重要的；
[0024] -相较于在实验模型中增加肿瘤生长的贝伐单抗（针对VEGF的抗体）而言 (Escudier等人，2010)，本发明的抗体抑制肿瘤生长；
[0025] -本发明的抗体靶向与经典VEGF/VEGFR途径不同的独立的血管生成途径，。CXCL 趋化因子途径既是血管生成性的又是炎性的。此外，CXCL趋化因子诱导自分泌增殖途径， 因为肿瘤细胞表达其受体CXCRl和CXCR2。因此，通过抑制相关的CXCL趋化因子（CXCL1、 CXCL7和CXCL8)，血管生成、炎症和增殖被本发明的抗体抑制。
[0026] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语和相关领域技术人员所通常理解 的具有相同的含义。
[0027] 为方便起见，提供了说明书和权利要求中使用的某些术语和短语的含义。
[0028] 如本文所用的术语"抗体"旨在包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例 如双特异性抗体）。更具体地，抗体（或"免疫球蛋白"）由糖蛋白组成，糖蛋白包含通过二 硫键相互连接的至少两条重（H)链和两条轻（L)链。
[0029] 每条重链包含重链可变区（或结构域）（本文中缩写为Vh)和重链恒定区（以下 称C h)。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和 IgE。免疫球蛋白IgG、IgD和IgA的重链恒定区（分别为γ、δ和α链）包含三个结构域 (CH1、CH2和CH3)和增加柔性的铰链区，而免疫球蛋白IgM和IgE的重链恒定区包含4个 结构域（CHI、CH2、CH3 和 CH4)。
[0030] 本发明的抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，这取决于它重链的结 构。然而，在一个优选的实施方式中，本发明的抗体是IgG同种型，也就是说它的重链是 ga_a( γ)类型。
[0031] 按照它们在血清中的丰度顺序，IgG抗体被分为四个不同的亚型，即IgGU IgG2、 IgG3和IgG4(IgGl最丰富）。γ链中铰链区的结构赋予这些亚型的每一个独特的生物谱 (尽管它们的Fc区之间有大约95%的相似性，铰链区的结构相对不同）。
[0032] 本发明的抗体可以是IgGU IgG2、IgG3或IgG4亚型。
[0033] 然而，在一个优选的实施方式中，本发明的抗体是IgGl亚型或IgG2亚型。
[0034] 每条轻链包含轻链可变区（本文缩写为VJ和仅包含一个结构域的轻链恒定区Q。 在哺乳动物中有两种类型的轻链：kappa( κ )链，其由2号染色体上的免疫球蛋白kappa基 因座编码，以及Iambda(A)链，其由22号染色体上的免疫球蛋白lambda基因座编码。在 一个优选的实施方式中，本发明的抗体具有kappa轻链。
[0035] Vh和Vl区可以进一步细分为高变区，称为"互补决定区"（⑶R)，其主要负责结合 抗原的表位，并且穿插在更保守的区域（称为"框架区"(FR))之间。每个V h和I由三个 ⑶R和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照下面的顺序排布：FR1、⑶RU FR2、⑶R2、 FR3、⑶R3、FR4。按照公知的惯例将氨基酸序列指定至各结构域（CHOTHIA等人，J. Mo 1. Biol.，1987 ;CH0THIA等人，Nature, 1989)。抗体结合特定抗原的功能能力取决于每个轻/ 重链对的可变区，很大程度上决定于CDR。不同B细胞产生的抗体当中重链可变区是不同 的，但是单个B细胞或B细胞克隆（或杂交瘤）产生的所有抗体是相同的。
[0036] 与此相反，抗体的恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系 统的各种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统的第一成分（Clq)。
[0037] 如本文所用，术语"抗体片段"旨在指定Fab、Fab'、F(ab'）2、scFv、dsFv, ds-scFv、 二聚体、微型抗体、双抗体及其多聚体和双特异性抗体片段，只要它们表现出所需的生物活 性（即它们针对趋化因子CXCLUCXCL7和CXCL8)。可以用常规技术将抗体片段化。已经开 发了各种技术用于生成抗体片段。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体得到这些片段。例 如，可通过胃蛋白酶处理抗体产生F(ab'）2片段。将所得的F(ab'）2片段进行处理以还原 二硫桥，从而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以导致Fab片段的形成。也可以通过重组 技术合成Fab、Fab'和F(ab'）2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性 抗体片段和其它片段。
[0038] 在本发明的上下文中，如果抗体对肽具有大于IO7M \优选大于5. IO7M \更优选大 于IO8M 1的亲和性常数K a (平衡解离常数的倒数，即1/KD)，则说所述抗体"针对"或"结合" 所述肽。
[0039] 亲和性常数被用于描述抗体（Ab)对肽或抗原（Ag)的结合，它是解离常数的倒数， 定义如下：
[0042] 例如通过平衡透析、通过荧光淬灭或通过表面等离子体共振，可以测量这种亲和 性，这些技术在本领域中是常规使用的。具体地，可以通过表面等离子体共振根据实施例中 描述的方法确定平衡解离常数（Kd)和亲和性常数（Ka)。
[0043] 具体地，正如通过表面等离子体共振所确定的，尤其是在25°C，更特别是根据实施 例中描述的Biacore?等离子体共振分析，本发明的分离的抗体或其片段能够以至多16nM 的平衡解离常数（Kd)结合人趋化因子CXCL1、以至多4nM的平衡解离常数（Kd)结合人趋化 因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数（K d)结合人趋化因子CXCL8。
[0044] 具体地，正如通过表面等离子体共振所确定的，尤其是在25°C，更特别是根据实施 例中描述的Biacore?等离子体共振分析，本发明的分离的抗体或其片段，能够以至多12nM 的平衡解离常数（Kd)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数（Kd)结合人趋化 因子CXCL7以及以至多20nM的平衡解离常数（K d)结合人趋化因子CXCL8。
[0045] 如本文所用，术语"CXCL1"涉及也被称为生长调节致癌基因 a (GR0- α )的CXC趋 化因子。
[0046] 优选，人CXCLl涉及由SEQ ID Ν0° 17所示序列编码的趋化因子（NCBI参考序列： ΝΜ_001511)ο
[0047] 如本文所用，术语"CXCL7"涉及也称为嗜中性粒细胞激活肽-2 (NAP-2)的CXC趋 化因子。
[0048] 优选，人CXCL7涉及由SEQ ID NO ° 18所示序列编码的趋化因子（GenBank: NM_002704)。
[0049] 如本文所用，术语"CXCL8"涉及也称为白细胞介素8 (IL-8)的CXC趋化因子。
[0050] 优选，人CXCL8涉及由SEQ ID NO ° 19所示序列编码的趋化因子（GenBank: NM_000584)。
[0051] 在本发明的描述中，进行参考的同一性百分比是基于待比较序列的全局比对而确 定的，也就是说使用例如Needleman和Wunsch 1970的算法，在其整个长度的范围比对序 列。例如使用needle软件通过使用等于10. 0的参数"开放空位"、等于0. 5的参数"延伸 空位"以及矩阵"BL0SUM 62"，可以完成这种序列比较。软件如needle可在世界范围内在 网站ebi. ac. uk获得，名称为"needle"。
[0052] 尤其是，根据本发明针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片 段包含至少一个，特别是至少两个、至少三个、至少四个、至少五个以及更具体地6个互补 决定区（CDR)，其选自包含或由以下组成的序列的CDR=SEQ ID No: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、在 SEQ ID NO: I 整个长度范围内和 SEQ ID NO: I 具有至少80 %、尤其是至少85 %、至少86 %、至少87 %、至少88 %、至少89 %、至少90 %、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%同一性的序列，在SEQ ID N0:2整个长度范围内和SEQ ID N0:2具有至少80%、尤其是 至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在 SEQ ID NO: 3整个长度范围内和SEQ ID NO: 3具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、 至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至 少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID NO:4整个长度 范围内和SEQ ID N0:4具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至 少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID NO: 5整个长度范围内和SEQ ID NO: 5 具有至少80 %、尤其是至少85 %、至少86 %、至少87 %、至少88 %、至少89 %、至少90 %、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%同一性的序列，在SEQ ID N0:6整个长度范围内和SEQ ID N0:6具有至少80%、尤其是 至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在 SEQ ID NO: 7整个长度范围内和SEQ ID NO: 7具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、 至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至 少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID NO:8整个长度 范围内和SEQ ID N0:8具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至 少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID N0:9整个长度范围内和SEQ ID N0:9 具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%同一性的序列，在SEQ ID NO: 10整个长度范围内和SEQ ID NO: 10具有至少80%、 尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的 序列，在SEQ ID NO: 11整个长度范围内和SEQ ID NO: 11具有至少80%、尤其是至少85%、 至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、 至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列或者在SEQ ID NO: 12整个长度范围内和SEQ ID NO: 12具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至 少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，尤其是选自由以下组成的 序列的 CDR:SEQ ID No:l、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:llSSEQID N0:12〇
[0053] 具体地，根据本发明针对人趋化因子CXCLl、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片 段包含6个互补决定区（⑶R)，其选自选自以下序列的⑶R :
[0054] -SEQ ID No:l、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12、在SEQ ID NO: I整个长度范围内和SEQ ID NO: I具有至少90%同一性的序列、在 SEQ ID N0:2整个长度范围内和SEQ ID N0:2具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID N0:3 整个长度范围内和SEQ ID N0:3具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID N0:4整个长度范 围内和SEQ ID N0:4具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID N0:5整个长度范围内和SEQ ID N0:5具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID N0:6整个长度范围内和SEQ ID N0:6具 有至少90%同一性的序列、在SEQ ID NO: 7整个长度范围内和SEQ ID NO: 7具有至少90% 同一性的序列、在SEQ ID N0:8整个长度范围内和SEQ ID N0:8具有至少90%同一性的序 列、在SEQ ID N0:9整个长度范围内和SEQ ID N0:9具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID NO: 10整个长度范围内和SEQ ID NO: 10具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID NO: 11 整个长度范围内和SEQ ID NO: 11具有至少90%同一性的序列、在SEQ ID NO: 12整个长度 范围内和SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的序列，尤其是SEQ ID No: 1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
[0055] 具体地，根据本发明针对人趋化因子CXCLl、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片 段包含：
[0056] -至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个⑶R，其选自包含或由以下组成的序 列的 CDR:SEQ ID No:l、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、在SEQ ID NO: I整个长度范围内和SEQ ID NO: I具有至少80%、尤其是至少85%、至 少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID NO:2 整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至 少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID NO: 3整个长度范围内和 SEQ ID NO: 3具有至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、 至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、 至少98%、至少99%同一性的序列，在SEQ ID NO: 7整个长度范围内和SEQ ID NO: 7具有 至少80%、尤其是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%同一性的序列，在SEQ ID N0:8整个长度范围内和SEQ ID N0:8具有至少80%、尤其 是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、 至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列 或者在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少80%、尤其是至少85%、至 少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列，尤其选自由以下 组成的序列的 CDR:SEQ ID No:l、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N