赖氨酸增强牛血清白蛋白修饰发光碳量子点荧光探针测定Cu的制作方法
【专利说明】赖氨酸增强牛血清白蛋白修饰发光碳量子点荧光探针测定
Cu2+
技术领域
[0001]本发明涉及生化分子技术领域，用BSA和Lys连续修饰⑶s来减少其表面缺陷实现增强其荧光信号的目的，不仅提高了方法的灵敏度，而且开发了测定Cu2+的荧光探针，扩展了 CDs的应用新领域。
【背景技术】
[0002]铜离子(Cu2+)是一种非常重要的生命元素，其在人体中的含量仅次于锌和铁，对于动物机体而言，它在许多重要生理活动如细胞呼吸、生物合成和代谢中有重要作用。但是过量的cu2+不仅会诱发各种神经疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森病和疯人病等，对藻类、真菌类、细菌和病毒等生命有机体也是有害的。因此，自然环境和生物体内Cu2+的选择性检测及控制对环境保护和人体健康具有重大意义。
[0003]发光碳量子点(CDs)是近年来出现的一种新型荧光纳米颗粒，具有化学惰性和良好的光学性能。与有机染料和半导体量子点相比较，CDs不仅荧光信号稳定，无光闪烁，激发波长和发射波长可调控，而且具有生物相容性好，毒性小等优势。目前CDs己被用于DNA、P043、溶菌酶、凝血酶、亚硝酸盐、葡萄糖、Ag\ Hg2+及生物巯基化合物、cu 2+的测定。
[0004]本发明采用赖氨酸(Lys)增强牛血清白蛋白(BSA)修饰碳量子点(⑶s)荧光探针测定痕量Cu2+0
【发明内容】
[0005]本发明的目的是建立一种新的人体Cu2+的检测方法。
[0006]本发明的技术方案是:借助1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的活化作用，利用牛血清白蛋白(BSA)的-NH2与碳量子点(CDs)的-C00H反应得到产物CDs-BSA，该产物中的-C00H和_順2与赖氨酸(Lys)中的-C00H和-NH2反应生成新的包覆层，减少CDs的表面缺陷，从而极大程度地提高CDs的荧光信号，首次开发了 CDs-BSA-Lys荧光探针；并基于Cu2+与CDs-BSA-Lys分子中的-C00H和_順2作用形成了不发荧光的配合物导致体系的荧光剧烈猝灭的现象，建立了 Lys增强BSA修饰CDs荧光探针测定痕量Cu2+的方法。包括如下步骤:
(1)Cu2+工作液:取1000 μ gmL 1 Cu2+标准溶液，逐级稀释成1.0 X 10 9mol mL 1，1.0X10 12 mol mL 1的Cu 2+溶液作为工作液。
[0007](2) CDs的制备:将4.000g葡萄糖和20.00 mL PEG-200混合后溶解在6.00 mL去离子水中，得到澄清的溶液。然后将该溶液放置于微波炉中，在540 W的功率下微波2 min,即得到淡黄色的⑶s。最后溶液经透析袋透析24小时后用水定容至100 mL。
[0008](3) BSA修饰CDs:取20.00 mL CDs，加入 10.00 mL 20.0 mM EDC和5.00 mL 20.0mMNHS，在37°C磁力搅拌条件下活化30 min后加入5.00 mL 50.0 mgmL ^SA，反应2小时。再将溶液放在4°C冰箱里隔夜使EDC和NHS去活化。之后将溶液在llOOOrpm条件下离心30min,以除去过多的BSA。取10.00 mL离心后的⑶s_BSA至100mL容量瓶中，并定容摇匀。
[0009](4)测定 Cu2+的过程:取 1.00 mL CDs-BSA、1.0 μ ml Lys、1.00 mL pH=5.00 的 PBS缓冲液和不同用量的Cu2+于lOmL比色管中，定容并迅速摇匀后，置于50°C水浴下反应10min，然后冰水浴冷却5 min。同时，进行空白实验。测定⑶s-BSA_LyS-Cu2+体系的荧光，其中试液的荧光强度为F:，空自液的荧光强度为F。，并计算TFbFfF。)。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0011]实施例1
采用赖氨酸(Lys)增强牛血清白蛋白(BSA)修饰碳量子点(CDs)荧光探针测定痕量Cu2+，包括如下步骤:
(1)Cu2+工作液:取1000 μ gmL 1 Cu2+标准溶液，逐级稀释成1.0 X 10 9mol mL 1，
1.0X10 12 mol mL 1的Cu 2+溶液作为工作液。
[0012](2) CDs的制备:将4.000g葡萄糖和20.00 mL PEG-200混合后溶解在6.00 mL去离子水中，得到澄清的溶液。然后将该溶液放置于微波炉中，在540 W的功率下微波2 min,即得到淡黄色的⑶s。最后溶液经透析袋透析24小时后用水定容至100 mL。
[0013](3) BSA修饰CDs:取20.00 mL CDs，加入 10.00 mL 20.0 mM EDC和5.00 mL 20.0mMNHS，在37°C磁力搅拌条件下活化30 min后加入5.00 mL 50.0 mgmL ^SA，反应2小时。再将溶液放在4°C冰箱里隔夜使EDC和NHS去活化。之后将溶液在llOOOrpm条件下离心30min,以除去过多的BSA。取10.00 mL离心后的⑶s_BSA至100mL容量瓶中，并定容摇匀。
[0014](4)测定 Cu2+的过程:取 1.00 mL CDs-BSA、1.0 μ ml Lys、1.00 mL pH=5.00 的 PBS缓冲液和不同用量的Cu2+于lOmL比色管中，定容并迅速摇匀后，置于50°C水浴下反应10min，然后冰水浴冷却5 min。同时，进行空白实验。测定⑶s-BSA_LyS-Cu2+体系的荧光，其中试液的荧光强度为F:，空自液的荧光强度为F。，并计算TFbFfF。)。
[0015]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.赖氨酸增强牛血清白蛋白修饰发光碳量子点荧光探针测定Cu2+，其特征在于:建立Lys增强BSA修饰⑶s荧光探针测定痕量Cu2+的方法。2.根据权利要求1所述的人体内重金属的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)Cu2+工作液:取1000 μ gmL 1 Cu2+标准溶液，逐级稀释成1.0 X 10 9mol mL \1.0X10 12 mol mL 1的Cu 2+溶液作为工作液； (2)CDs的制备:将4.000g葡萄糖和20.00 mL PEG-200混合后溶解在6.00 mL去离子水中，得到澄清的溶液；然后将该溶液放置于微波炉中，在540 W的功率下微波2 min，即得到淡黄色的⑶s ;最后溶液经透析袋透析24小时后用水定容至100 mL ;(3)BSA 修饰 CDs:取 20.00 mL CDs，加入 10.00 mL 20.0 mM EDC 和 5.00 mL 20.0mMNHS，在37°C磁力搅拌条件下活化30 min后加入5.00 mL 50.0 mgmL ^SA，反应2小时；再将溶液放在4°C冰箱里隔夜使EDC和NHS去活化；之后将溶液在llOOOrpm条件下离心30min,以除去过多的BSA ;取10.00 mL离心后的⑶s_BSA至100mL容量瓶中，并定容摇匀；(4)测定Cu2+的过程:取 1.00 mL CDs-BSA、1.0 μ ml Lys、L00 mL pH=5.00 的 PBS 缓冲液和不同用量的Cu2+于10mL比色管中，定容并迅速摇匀后，置于50°C水浴下反应10 min,然后冰水浴冷却5 min ;同时，进行空白实验；测定CDs-BSA-Lys-Cu2+体系的荧光，其中试液的荧光强度为F:，空自液的荧光强度为F。，并计算TFbFfF。)。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用pH=5.00的PBS溶液来调节体系的酸度。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，反应的温度和时间分别设定为 50°C、lOmin。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，用423nm为工作波长实现对Cu2+含量的测定。
【专利摘要】本发明公开了一种人体内重金属离子的检测方法。本发明的技术方案是借助l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的活化作用，利用牛血清白蛋白（BSA）的-NH2与碳量子点(CDs)的-COOH反应得到产物CDs-BSA，该产物中的-COOH和-NH2与赖氨酸（Lys）中的-COOH和-NH2反应生成新的包覆层，减少CDs的表面缺陷，从而极大程度地提高CDs的荧光信号，首次开发了CDs-BSA-Lys荧光探针；并基于Cu2+与CDs-BSA-Lys分子中的-COOH和-NH2作用形成了不发荧光的配合物导致体系的荧光剧烈猝灭的现象，建立了Lys增强BSA修饰CDs荧光探针测定痕量Cu2+的方法。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105403547
【申请号】CN201510832640
【发明人】刘乃山, 冯骋武, 刘翠珍
【申请人】青岛康原药业有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月26日