针对乳粉中α-乳白蛋白的高效分离和精确定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种分离、检测的技术领域，具体设及一种利用高效凝胶液相色谱分 离、检测乳粉中α-乳白蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 母乳是婴儿成长最好的食物，但是，因各种原因不能母乳喂养或母乳供应不足情 况下，婴儿配方乳粉成为可供选择的最佳食品之一。如今，婴儿配方乳粉的研制进程逐渐由 宏观调整走向了微观调整，W使其更接近母乳。α-乳白蛋白是最近在国内外引起广泛关注 的、母乳中存在而普通配方乳粉中含量较少的、对婴儿发育非常重要的乳蛋白质。
[0003] 牛乳与母乳最显著的差别是其色氨酸和半脫氨酸浓度低，而α-乳白蛋白中含有 丰富的赖氨酸和半脫氨酸，特别是色氨酸含量非常高，色氨酸和半脫氨酸除了都有助蛋白 质结合的作用之外，对于不同生理，两者在氨基酸利用的重要途径中都是必不可少的组 份。例如，色氨酸是神经传递介质5-径色胺的前体，色氨酸状况可能会对有意识的行为 和睡眠状况有影响。半脫氨酸是谷脫甘肤的组份，因此与保护机体组织防止过氧化损耗有 关，半脫氨酸还是合成牛横酸的前体。
[0004] 用普通配方乳粉喂养的婴儿和用母乳喂养的婴儿相比，两者血浆中含有的氨基酸 水平具有明显差距，前者特别是在色氨酸水平上表现很低。所W维持色氨酸和半脫氨酸 的需要可W作为婴儿配方乳粉的一个重要指标，α-乳白蛋白的存在补足了其它蛋白质成 分中相对缺少的色氨酸、赖氨酸和半脫氨酸。运些依据表明，需要在婴儿配方乳粉中加入 α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例。
[0005] 婴儿配方乳粉一般都经过严格的杀菌处理，婴儿配方乳粉中的蛋白质在加热杀菌 处理后会产生不同程度的Ξ维空间变性，因此，能否将变性的和非变性的α-乳白蛋白提 取出来，直接影响分析结果。
[0006]α-乳白蛋白的检测方法主要有聚丙締酷胺凝胶电泳（PAGE)、反相高效液相色谱 (RP-HPLC)、离子交换液相色谱（FPLC)、高效毛细管电泳（HPCE)，但存在着重现性差、对加 工后乳制品的分离定量不理想、需要预先分离乳清蛋白与酪蛋白等问题。目前，国标中还没 有规定乳粉中α-乳白蛋白的检测方法。由于没有相应的国家标准和行业标准，企业不能 控制产品的质量，质量监督部口也不能对市场上产品进行监督，因此我们急需一种能准确 可靠、方便快捷的检测乳粉中α-乳白蛋白的方法。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有高效液相色谱法检测乳粉中α-乳白蛋白 含量分离不理想、定量不准确、不能检测变性的α-乳白蛋白的缺陷，提供一种利用高效凝 胶液相色谱分离检测乳粉中α-乳白蛋白的方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0009]针对乳粉中α-乳白蛋白的高效分离和精确定量检测方法，该方法通过高效凝胶 液相色谱法进行检测，针对乳粉特性设定所使用的处理试剂及试剂用量及处理参数，实现 乳粉中α-乳白蛋白的高效分离和精确定量检测。
[0010] 作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤： Α、α-乳白蛋白的提取：在下述Ξ种方式中任选其一进行乳粉中α-乳白蛋白的提取： 采用盐酸调节抑值提取、盐酸脈溶液和琉基乙醇提取、醋酸盐缓冲溶液提取； Β、高效凝胶液相色谱法检测：高效凝胶液相色谱的流动相采用下述两种溶液的任一 种：ρΗ=4. 5-7. 5的4-8mol/L的盐酸脈溶液、乙腊/水/Ξ氣乙酸按体积比40-50/50-60/0. 1 配制的溶液；W流速0. 4-0. 8mL/min洗脱样品，柱溫25-40°C;检测波长为210-280皿。
[0011] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，在下述Ξ种方式中任选其一进行乳 粉中α-乳白蛋白的提取：采用盐酸调节抑=4. 6提取、盐酸脈溶液和琉基乙醇提取、pH=4. 6 的醋酸盐缓冲溶液提取； 作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，α-乳白蛋白的提取采用盐酸脈溶液溶 解样品再加入琉基乙醇进行处理，其中盐酸脈溶液浓度为5-7moL/l，琉基乙醇的量为每 1. 5mL盐酸脈溶液添加5-20μL。
[0012] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤Β中所述的高效凝胶液相色谱柱采用 TSK-GelG2000SWXL5ym、TSK-GelG3000SWXLδμL?、TSK-GelG2000SWΙΟμπι凝胶柱中 的任一种。
[0013] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤Β中所述的流动相采用抑为5. 5-7. 5的 5- 7. 5mol/L的盐酸脈溶液，W流速0. 4-0. 7血/min洗脱样品，柱溫25-35Γ。
[0014] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中所述的流动相采用抑为6. 0-7. 5的 6- 7mol/L的盐酸脈溶液，W流速0. 4-0. 6mL/min洗脱样品，柱溫25-30°C。
[0015] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中所述的检测波长为270-280nm。
[0016] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，样品的进样量为30-65yL。
[0017] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，样品的进样量为40-55yL。
[0018] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于： ①本发明要克服了现有高效液相色谱法检测乳粉中α-乳白蛋白含量分离不理想、定 量不准确、不能检测变性的α-乳白蛋白的缺陷，具有简单方便、分离度好，准确度高的优 点。
[0019] ②本发明通过创新性的研发，针对乳粉特性设定所使用的处理试剂及处理参数， 实现了对乳粉中变性及非变性α-乳白蛋白的一步式精准检测，相比现有技术具有质的提 升。
[0020] ③申请人的系列试验验证，采用本发明方法检测乳粉中α-乳白蛋白含量，其重 现性达到RSD《5%，表1显示了同一样品α-乳白蛋白10次检测结果及RSD。
[0021] 表1α-乳白蛋白重现性结果_
④采用本发明方法检测乳粉中α-乳白蛋白含量，回收率达到93-106%。表2为乳粉中 添加不同量的α-乳白蛋白标准品检测出的回收率。
[0022] 表2α-乳白蛋白回收率试验结果
⑥参见附图1，采用本发明的方法检测α-乳白蛋白，标准曲线线性相关系数达到 0. 999W上，W信噪比S/N=3计算乳粉中α-乳白蛋白的检出限为0. 3mg/g。
【附图说明】
[002引图1是α-乳白蛋白标准曲线图，显示采用本发明的方法检测α-乳白蛋白，其标 准曲线线性相关系数达到0. 999W上。
[0024] 图2是本发明实施例1中α-乳白蛋白标准品图谱；图中峰a是α-乳白蛋白。
[0025] 图3是本发明实施例1中婴儿配方乳粉样品α-乳白蛋白图谱；图中峰a是α-乳 白蛋白。
【具体实施方式】
[0026] W下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市 售产品，均能够通过市场购买直接获得。
[0027] 实施例1 1)准确称取含有大约相当于lOmg蛋白质的样品，样品溶在盛有流动相溶液的lOmL容 量瓶中，从W上样品中转移1. 5血于10血离屯、管中，加入10μLβ-硫基乙醇，摇动混合约 1