检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及酶联免疫检测技术，具体设及一种用于检测多菌灵的酶联免疫试剂盒 及其应用，可定性、定量检测烟叶中多菌灵药物的残留量。
【背景技术】
[0002] 我国是生产和使用化学农药的大国，长期使用农药对生态环境W及人体健康的危 害和影响已经引起人们的高度关注。多菌灵[carbendazim，N-(2-苯并化挫基）氨基甲酸 甲醋]为苯并化挫类，是一种良好的广谱、内吸性杀菌剂，对子囊菌、担子菌W及半知菌类 中的大多数病原菌都有效，广泛应用于农作物W及中草药的病害防治工作中。多菌灵化学 性质稳定，能被植物的种子、根和叶吸收，残效期较长，对人、畜均有一定毒性，可引起抽摇、 精神恍惚、恶屯、呕吐、胸闷、头晕等中毒症状。因此，有关多菌灵残留量的分析已经越来越受 到重视。
[0003] 由于多菌灵在农作物病害的防治方面有着广泛的应用，但其对人体又有一定的毒 害性，目前世界许多国家都制定了多菌灵在不同种（类）农副产品中残留量的最高限量标 准。加拿大国家标准规定黄瓜、西葫芦等蔬菜中多菌灵残留量每公斤不得超过0.5mg;马 来西亚规定蔬菜类中多菌灵残留量每公斤不得超过1mg;我国卫生标准GB14870294中规 定蔬菜、水果中多菌灵残留量每公斤不得超过0.5mg。但目前尚无简单、快捷的检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是针对上述现有技术状况而提供一种能够检测烟叶中多菌灵药 物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定 量检测方法，应用本发明的酶联免疫法测定烟叶中多菌灵药物的残留量，具有检测限低、特 异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。 阳〇化]本发明的目的是通过W下技术方案来实现的：本发明的试剂盒包括：包被有包被 原的酶标板、多菌灵标准品溶液、多菌灵抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涂液、复溶 液，所述包被原为多菌灵偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的多菌灵抗抗体，所述多菌灵偶 联抗原是由多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述多菌灵半抗原是由多菌灵和Ξ氣乙酸 酢、硝酸锭反应得到。
[0006] 所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋 白、血蓝蛋白。
[0007] 所述多菌灵半抗原分子结构式为：
[0008] 所述多菌灵抗体是W多菌灵偶联抗原作为免疫原制备获得，所述多菌灵抗体为多 菌灵单克隆抗体或多菌灵多克隆抗体，其中优选多菌灵单克隆抗体。
[0009] 所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性憐酸醋酶，其中优选辣 根过氧化物酶；酶标二抗是由酶和多菌灵抗抗体偶联得到的。
[0010] 为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括多菌灵标准品溶液、底 物显色液、终止液、洗涂液、复溶液。
[0011] 所述多菌灵标准品溶液6瓶，浓度分别为0μκ/1、0. 1μκΑ，0.3μκΑ，0.9μκΑ， 2. 7μg/L，8. 1μg/L。
[0012] 当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液Β液组成， A为过氧化氨或过氧化脈，Β液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2mol/L的硫 酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性憐酸醋酶时，所述底物显色液为对硝基憐 酸盐缓冲液，所述终止液为1~2mol/L氨氧化钢溶液。
[0013] 所述洗涂液优选为抑值为7. 4,含有0. 5%~1. 0%吐溫-20、0. 01%〇~0. 03%〇叠氮化 钢防腐剂、0. 1~0. 3mol/L的憐酸盐缓冲液，其中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。
[0014] 所述复溶液优选为抑值为7. 0、0. 02mol/L的憐酸盐缓冲液。
[0015] 其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为抑值为9. 6,0. 05mol/L的碳酸 盐缓冲液，封闭液为抑值为7. 1~7. 5,含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的憐酸盐 缓冲液。
[0016] 本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mU每孔加 入100μL25°C避光解育2h或4°C过夜，倾去孔中液体，用洗涂液洗涂2次，每次30S，拍 干，然后在每孔中加入150~200μL封闭液，25°C避光解育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥 后用侣膜真空密封保存。
[0017] 本发明的检测原理为： 本试剂盒采用直接竞争化ISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留 的多菌灵和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗多菌灵的酶标二抗，用TMB底物显 色，样本吸光度值与其所含残留物多菌灵的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘W其对应 的稀释倍数，即可得出样本中多菌灵的残留量。
[0018] 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测多菌灵的方法，它包括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用试剂盒进行检测； (3) 分析检测结果。
[0019] 本发明检测多菌灵的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品 中多菌灵的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样 品；主要试剂W工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有检测限低、特异性高、操作简 便、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、 价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。
【附图说明】
[0020] 图1 :多菌灵半抗原合成路线图， 图2 :试剂盒柄；准曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0022] 实施例1试剂盒组分的制备 1、多菌灵半抗原的制备 多菌灵原料药经硝化反应，在苯环上引入硝基，经还原后得到带有芳香胺的半抗原产 物。 阳02引 Ξ氣乙酸20血加立氣乙酸酢2血，冰水浴，降至0°C，加硝酸锭0. 5g，揽拌1h， 加入含多菌灵1.0g的Ξ氣乙酸溶液，继续揽拌，反应2h。停止反应，就稀氨氧化钢溶液 中和到中性，二氯甲烧萃取，水洗，蒸干，乙酸洗涂结晶，得到化合物a0.76g，收率67%。1H NMR(CDC13,300M监）δ: 8. 31 (1H,dd,片1.616，tl.239), 7. 69 ( 1H,dd,t8. 716， J=1.616), 7.64 (IH,dd,t8. 716，J=l. 239)，3.85 (3H，s)。
[0024]化合物a0. 7g加乙醇溶解，加0. 43g氯化锡水溶液10mL，通入氮气，加入回流 反应3h。停止反应，旋蒸除去乙醇，加乙酸乙醋萃取，浓缩上硅胶柱，石油酸/乙酸乙醋（1 : l，v/v)洗脱分离，得到半抗原化合物b产物0. 54g，收率，83%。1HNMR(CDC13,300M监） δ:3.79 (3H,s),6. 27 (2H,s), 6.90 (IH,dd,J=2. 225,J=1.850), 6.46 (IH,dd, t8. 422，J=2. 225),7.：M(IH,dd,t8. 422，J=l. 850)，5.00(1?s), 9.15(1?s)。
[00巧]图谱中化学位移5=6.27的为苯环上芳香胺的共振吸收峰，该吸收峰的存在证 明，半抗原合成成功。 阳0%] 2、抗原的制备 免疫原制备一一多菌灵半抗原与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到免疫原。
[0027] 称取BSA50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1M的憐酸盐缓冲液PBS(PH7. 2)中， 得到溶液A;取30mg碳化二亚胺（EDC)和N-径基班巧酷亚胺（畑S)用0. 2血水充分溶解 后于加入溶液A中，室溫下揽拌30min。取15mg半抗原，溶解于1血N，N-二甲基甲酯胺 (DMF)中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室溫揽拌反应24h。用0.01mol/LPBS4°C透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0028] 多菌灵半抗原与血蓝蛋白偶联得到免疫原。
[0029] 称取血蓝蛋白50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1M的憐酸盐缓冲液PBS(PH7. 2) 中，得到溶液A;取30mg碳化二亚胺（邸C)和N-径基班巧酷亚胺（畑S)用0. 2血水充分 溶解后于加入溶液A中，室溫下揽拌30min。取5mg半抗原，溶解于1血N，N-二甲基甲 酷胺（DMF)中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室溫揽拌反应24h。用0.01mol/LPBS4°C 透析3d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0030] 多菌灵半抗原与甲状腺蛋白偶联得到免疫原。
[0031] 称取甲状腺蛋白50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1M的憐酸盐缓冲液PBS(PH 7. 2)中，得到溶液A;取30mg碳化二亚胺（EDC)和N-径基班巧酷亚胺（NHS)用0. 2血水 充分溶解后于加入溶液A中，室溫下揽拌30min。取3mg半抗原，溶解于1血N，N-二甲 基甲酯胺（DMF)中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室溫揽拌反应24h。用0.01mol/LPBS 4°C透析3d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0032] 包被原制备一一多菌灵半抗原与卵清蛋白（OVA)偶联得到包被原。 阳03引称取OVA50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1MPBS(PH7. 2)中，得到溶液B;取 30mgEDC和N服用0. 2血水充分溶解后于加入溶液B中，室溫下揽拌30min。取13mg半 抗原，溶解于ImLDMF中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室溫揽拌反应24h。用0.01mol/ LPBS4°C透析3d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0034] 多菌灵半抗原与人血清白蛋白偶联得到包被原。 阳03引称取人血清白蛋白50m