热休克蛋白90(hsp90)化学发光检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床血液免疫检测技术领域，具体的，本发明提供了一种热休克蛋白 90 (HSP90)化学发光检测试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定 等优点。该试剂盒检测的灵敏度高，特异性强。
【背景技术】
[0002] 休克蛋白化eat化ockProtein,服巧是1962年由遗传学家Ritossa发现的，运 是一类在生物进化过程中高度保守并广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。热休克蛋白 是生物受到环境中的物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而合成的蛋白质，能够 维持信号转导蛋白的功能，在细胞突变过程中是一个重要的缓冲因子，调控着多种细胞生 理、生化变化过程中重要蛋白的空间结构和突变。根据分子质量大小不同，热休克蛋白可分 为服P100、服P90、服P70、服P60和小服P五大家族。服P90的分子量约为83~90kda，含 有732个氨基酸，保守的N-末端约为25kda，由第1~235位氨基酸组成，链接区（linker region，LR)由第235~272氨基酸组成，中间区域（theMiddleDomain,Μ)由第272~629 氨基酸组成，5化da的C-末端由第629~732氨基酸组成。20世纪90年代初，Blachere等 [引证实，从肿瘤细胞中提取获得的热体克蛋白可W导致宿主产生很强的免疫反应，运可能 是由于运种热体克蛋白可W作为一些肿瘤抗原的分子伴侣。服P90还参与肿瘤血管的生长、 侵袭及转移。研究表明，肿瘤组织中服P90呈高表达状态，通过免疫组化可观察到服P90表 达与肿瘤的分化程度，淋己结的转移有不同程度的相关。 近十几年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础 理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，广泛应用 于PAP的定量分析的方法主要是放射免疫分析巧IA)和酶联免疫吸附分析巧LISA)，其中 RIA必须用1251等放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，必须用专口的仪器测定，其放射性 核素的半衰期短，不能长期保存，测定结果不稳定，同时也给操作人员带来了放射性伤害。 ELISA检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性等缺点也不 能满足临床的要求。化学发光免疫分析方法（CLIA)应运而生。 化学发光分析超微量物质，尤其是临床分析微量的活性物质始于20世纪70年代，随后 在临床上的应用进入一个飞速发展时期。化学发光免疫分析方法（CLIA)灵敏度高，可W达 至IJ10-18mol/L;快速，发光信号在几秒钟内产生；操作简便，测试过程中不使用有害试剂。 本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光 信号代替酶联免疫分析中的显色底物，其灵敏度得到大大提高。本发明所述方法操作简便， 适用性广，可实现大批量快检测，使用成本低，更易在临床诊断和科研工作推广应用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种热休克蛋白90(HSP90)化学发光检测试剂盒及其制备 方法。
[0004] 为达到上述目的，本发明采用如下方案：
[0005] 根据本发明的热休克蛋白90(服P90)化学发光检测试剂盒包括W下组分：
[0006] ①热休克蛋白90WSP90))标准品，所述热休克蛋白90简称服P90;
[0007] ②包被有热休克蛋白90 (服P90)单克隆抗体的磁颗粒；
[0008] ③酶标记的热休克蛋白90 (服P90)单克隆抗体；
[0009] ④上述酶作用的化学发光底物A和B;
[0010] ⑥洗涂液；
[0011] ⑧白色不透明微孔板。
[0012] 其中，所述包被有服P90单克隆抗体的磁颗粒经过W下步骤制备：
[0013] ①取5. 0ml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子 水洗磁颗粒；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为0. 05mol/l、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲 液；
[0014] ②用0. 05mol/L抑值为6.5的憐酸盐缓冲液洗磁颗粒；
[0015] ③将0. 05mol/L抑值为6.5的憐酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体 积为5. 0~10. 0ml ;
[0016] ④加入5. Omg服P90单抗，于摇床上匀化5~10分钟；
[0017] ⑥加入5. 0~10.Omg碳二亚胺，于摇床上匀化5~10小时；
[001引⑧用0.Imol/L抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液洗涂2次；
[0019] ⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5. 0ml，调抑为7. 5, 2~4°C保存。
[0020] 所述辣根过氧化物酶标记的服P90单克隆抗体是用下述方法制备：
[0021] ①取1.Omg服P90单克隆抗体，加入0. 5~1. 0ml浓度为0. 05mol/L，抑值为7. 5 的憐酸盐缓冲液溶解，2~4°C保存；
[002引②取5. Omg的辣根过氧化物酶，加入0. 5ml去离子水，溶解后取出0. 06~0. 12ml，加入0. 1ml浓度为0.Imol/L的化104溶液，室溫下避光反应0.5~1.5小时；
[0023] ③将步骤①与②获得的液体混合，室溫下避光反应4~6小时；
[0024] ④向步骤③获得的溶液中加入0. 1ml浓度为5mg/mlNaBH4溶液室溫下避光反应 1~2小时；
[002引⑥用0. 02mol/L，抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液透析12~24小时，再用HPLC进行 二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积的甘油后于-20°C下冷冻保存。
[0026] 3所述洗涂液是用下述方法制备： 取6.05gS径甲基氨基甲烧、8. 55g化C1、0. 5mlTween-20,加去离子水1000ml，溶解后 用肥1调抑至7. 5。
[0027] 4.所述化学发光底物工作液是用下述方法制备的：
[0028] 所述化学发光底物A液：
[0029] ①配制0. 05mol/LpH值为 8. OTris-Hcl缓冲液；
[0030] ②将3~4mmol鲁米诺加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2~4°C避光 保存。
[0031] 所述化学发光底物B液：
[0032] ①配制0. 05mol/L抑值为8.OTris-Hcl缓冲液；
[0033] ②将0. 5~0. 7mmo1四苯棚钢、1. 42mmo1铁氯化钟、0. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol过 氧化氨加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2~4°C保存。
[0034] 使用方法：使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。
[0035] 本发明的优点：
[0036] 本发明试剂盒可W检测病人血清中HSP90的含量，对于非小细胞肺癌及其它肿瘤 的检测具有重要的指导意义，与传统的化ISA方法相比，本发明的试剂盒灵敏度度高，特异 性强，安全可靠。
【附图说明】
[0037] 图1服P90试剂盒（实施例1)标准曲线。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0039] 实施例1
[0040] 一种热休克蛋白90(服P90)化学发光检测试剂盒，包括W下组份：
[0041] ①热休克蛋白90WSP90))标准品，所述热休克蛋白90简称服P90 ;
[0042] ②包被有热休克蛋白90 (服P90)单克隆抗体的磁颗粒；
[0043] ③酶标记的热休克蛋白90 (服P90)单克隆抗体；
[0044] ④上述酶作用的化学发光底物；
[004引⑥洗涂液；
[0046] ⑧白色不透明微孔板。
[0047] 其中，所述包被有服P90单克隆抗体的磁颗粒经过W下步骤制备：
[0048] ①取5. 0ml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子 水洗磁颗粒；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为0. 05mol/l、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲 液；
[0049] ②用0. 05mol/L抑值为6.5的憐酸盐缓冲液洗磁颗粒1次；
[0050] ③将0. 05mol/L抑值为6. 5的憐酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体 积为5. 0ml;
[0051] ④加入5.Omg服P90单抗，于摇床上匀化5分钟；
[005引⑥加入5. 0~10.Omg碳二亚胺，于摇床上匀化5小时；
[005引⑧用0.Imol/L抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液洗涂2次；
[0054] ⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5. 0ml，调抑为7. 5, 2~4°C保