一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草化学成分的测定方法技术领域，具体涉及一种烟草根、茎及叶中 多胺类物质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 多胺是生物体代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪含氮碱。常见多胺 有腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。在高等植物中主要以游离态形式存在，并且在不同的组织与 器官间存在差异。在植物中，多胺具有刺激生长，延缓衰老的作用。一般认为多胺可作为 广义上的植物激素，也有人认为多胺可能是类似cAMP那样的"第二信使"，调节植物的生长 发育。此外，多胺与植物的抗逆性也密切相关，研究发现，植物在自主抵抗遭遇的逆境胁迫 时，多胺不仅与其他相溶性溶质一样有类似的保护功能，而且还与这些相溶性溶质有协同 作用，在植物逆境抵抗体系的构建中起重要的推动作用。
[0003] 在烟草中，多胺除了有上述重要作用外，利用多胺合成烟碱中的吡咯烷环是烟草 生长过程中非常重要的代谢过程。该过程主要包含多胺的合成与吡咯烷环的合成。多胺 的合成途径主要有两条：一条为精氨酸途径，其关键酶是精氨酸脱羧酶，另一条为鸟氨酸途 径，其关键酶是鸟氨酸脱羧酶。合成的腐胺经过腐胺N-甲基转移酶形成N-甲基腐胺，进 一步由腐胺N-甲基氧化酶氧化得到N-甲基氨基丁醛，N-甲基氨基丁醛自发转变为合成烟 碱所必须的吡咯烷环，从而形成烟碱。由上述途径可知，烟草中的多胺类物质是直接形成 烟碱的前体物，对多胺类物质进行检测分析，能深入的了解烟碱的合成途径，能为指导获得 高烟碱优质烟叶提供一定的理论基础。此外，烟草中的多胺还能参与合成苯乙烯酰胺类物 质，烟草中已经鉴定的苯乙烯酰胺类物质有咖啡酰丁二胺、二咖啡酰氧基亚精胺、咖啡酰氧 基-去氢咖啡酰氧基亚精胺、阿魏酰酪胺等，这些物质与烟草的抗逆性相关，特别与植株的 病毒抗性密切相关。
[0004] 目前还没有一套简单、快速、高灵敏度和对环境绿色友好的关于烟草根、茎及叶中 多胺类物质的检测方法。建立一套简单、快速、高灵敏度、对环境绿色友好且准确的方法以 提高样品检测通量，减少环境污染是非常必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题：提供一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，该 方法具有衍生化反应快，产物稳定、灵敏度高、对环境绿色友好且准确等特点，该方法的这 些优点有效的克服了现有技术的不足。
[0006] 本发明技术方案：
[0007] -种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，包括以下步骤：
[0008] A、烟草根、茎及叶中多胺类物质的提取：称取冻干样品于离心管中，然后加入内标 溶液，再加入预冷的高氯酸水溶液进行涡旋提取，离心后，上层清液过水系滤膜；
[0009] B、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化：取步骤A中滤液于离心管中，放入冰浴 中冷却，再加入氢氧化钠溶液，涡旋混匀后加入预冷的衍生化试剂，涡旋混匀，冰浴中反应 后加入盐酸水溶液停止反应；
[0010] C、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化产物的提取：向步骤B中衍生化产物中 加入水，调节溶液pH值后，再加入氯化钠及提取溶剂进行涡旋辅助-液液微萃取，提取结束 后用手动进样针取下层提取液至微量进样瓶中，氮气吹干后用乙腈水溶液将衍生化产物溶 解后进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器测定；
[0011] D、烟草根、茎及叶中多胺类物质的色谱检测：采用一级与二级高分辨质谱定性标 准品与未知多胺，超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器以己二胺盐酸盐为内标分别进 行绝对定量与相对定量。
[0012] 所述内标溶液为5uL0. 1M盐酸配制的lmgmL1的己二胺盐酸盐。
[0013] 所述的衍生化试剂为1050uL乙腈配制的50mM的3, 5-二硝基苯甲酰氯。
[0014] 所述的涡旋辅助-液液微萃取的条件为加入lmL超纯水，利用2M的盐酸将其pH 调至1后，再加入2.5%的氯化钠（w/v)与250uL三氯甲烷，涡旋辅助液液微萃取3min， 4000rpm离心4min分层。
[0015] 所述的一级与二级高分辨质谱定性的标准品为腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。
[0016] 所述的一级与二级高分辨质谱定性的未知多胺有酪胺、1，3-丙二胺、高精眯和刀 豆四胺。
[0017] 所述的超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器利用标准品绝对定量腐胺、尸 胺、亚精胺和精胺，利用内标己二胺盐酸盐按照校正因子F= 1相对定量酪胺、1，3-丙二胺、 高精眯和刀豆四胺。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 由于多胺挥发性差，极性强，且未有紫外吸收的生色团等特性，直接检测法存在峰 形不对称、灵敏度低，选择性不强等缺陷，因此，多胺的检测方法主要为衍生化方法，衍生方 法主要有气相衍生与液相衍生二种方法。气相衍生主要利用乙酰化衍生氨基，提高多胺的 挥发性，从而可以利用气相色谱进行检测。乙酰化需无水的条件下反应，提取的多胺必须进 行完全除水后才能进行衍生，且反应易受到水的影响，此外，乙酰化产物的沸点依然较高， 需要高于280°C的柱温才能从色谱柱中流出而被检测，因此易导致毛细管色谱柱的流失， 甚至损坏。液相衍生主要是将生色团引入到多胺的结构中，从而使其有紫外吸收或发出荧 光。主要的液相衍生试剂有邻苯二甲醛、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基 氨基甲酸酯、氯甲酸芴甲酯和苯甲酰氯。但这些衍生试剂都存在衍生反应慢，衍生产物稳定 性差，且价格较昂贵等缺陷。此外，这些方法常常采用衍生化后直接进样或液液萃取进行浓 缩，导致方法灵敏度低且需消耗较多量的有机溶剂。
[0020] 本发明建立了一种以预冷的高氯酸溶液涡旋提取烟草中的多胺，再以3, 5-二硝 基苯甲酰氯进行衍生化，衍生化产物利用涡旋辅助-液液微萃取进行提取浓缩后采用超高 效液相色谱-光电二极管阵列检测器进行检测的方法。同时本发明为了获得涡旋辅助-液 液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分别采用了部分析因设计和Doehlert设计进行方 法优化。与现有技术相比，本方法的优点是：采用3, 5-二硝基苯甲酰氯衍生化多胺，有效减 少了衍生化反应时间，提高了衍生化产物的稳定性，且利用一级与二级高分辨率质谱发现 了其它四种多胺，分别为酪胺、1，3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺，其中刀豆四胺为首次在烟 草中发现；利用涡旋辅助-液液微萃取的方法，减少了有机溶剂的使用及提取的时间，提高 了方法的灵敏度。本发明具有衍生反应快、产物稳定，灵敏度高、重现性好、对环境绿色友好 等优点，能对烟草中根、茎及叶中的多胺进行准确的定性与定量。
【附图说明】
[0021] 图1本发明中烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法流程图；
[0022] 图2腐胺、尸胺、亚精胺和精胺混合标准溶液UPLC-PDA(240nm)色谱图（A-未优化 色谱图；B-衍生化优化后色谱图；C-涡旋辅助-液液微萃取优化后色谱图、6. 88min-腐胺； 7. 51min-尸胺；8. 62min-己二胺盐酸盐内标；9. 30min-亚精胺；10. 87min-精胺）；
[0023] 图3烟草中根、茎及叶中多胺类物质的典型UPLC-PDA(240nm)色谱图（A-茎； B-根；C-叶、1:5. 43min-酪胺；2:6. 64min-l, 3-丙二胺；3:6. 91min-腐胺；4:7. 55min-尸 胺；IS:8. 64min-己二胺盐酸盐内标；5:9. 34min-亚精胺；6:9. 73min-高精眯； 7:10. 90min_ 精胺；8:11. 09min_ 刀豆四胺）；
[0024] 图4为高精眯的裂解规律图。 具体实施方案[0025] 实施例1
[0026] 本发明烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法包括如下步骤：
[0027] (1)称取100mg的冻干样品（根、茎或叶）于10mL的离心管中，然后加入5uL0·1M 盐酸配制的lmgmL1的己二胺盐酸盐，再加入6mL预冷的0. 3M高氯酸水溶液进行涡旋 2000rpm提取30min，4000rpm离心5min后，上层清液过0· 45um水系滤膜；
[0028] (2)取2mL滤液于10mL离心管中，放入冰浴中冷却5min，再加入400uL4M的氢氧 化钠溶液，涡旋混匀后加入预冷的1050uL乙腈配制的50mM的3, 5-二硝基苯甲酰氯，涡旋 混匀，冰浴中反应2min后加入500uL2M盐酸水溶液停止反应；
[0029] (3)向衍生化产物中加入lmL超纯水，利用2M的盐酸将其pH调至1后，再加入 2. 5%的氯化钠（v/w)与250uL三氯甲烧，祸旋辅助液液微萃取3min，4000rpm离心4min分 层。用100uL手动进样针取下层提取液至微量进样瓶中，氮气吹干后用50uL乙腈水溶液 (V/V9:1)溶解后进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器测定；
[0030] (4)采用一级与二级高分辨质谱定性标准品（腐胺、尸胺、亚精胺和精胺）与未 知多胺（酪胺、1，3-