基于磁珠包被抗体的微流控芯片及捕获心肌标志物的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及免疫磁珠包被结合抗体领域，尤其涉及一种基于磁珠包被抗体的微流 控芯片及捕获心肌标志物的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，微流控技术在生化分析、免疫诊断、环境检测等领域具有重要进展，如在精 细控制流速的前提下，控制抗原抗体反应，从而达到对免疫反应的高灵敏度控制。通过范德 华力、静电吸附、高分子包埋等手段心肌抗体被包被于反应微室中，进行抗原捕获。为达到 即时检测的目的，微通道中通过高传质达到免疫底物充分的混合，进而存在包被抗体复溶 于流体系统及被流体中抗原捕获脱离包被基材等问题。
【发明内容】
[0003] 本专利目的是提供一种基于磁珠包被抗体的微流控芯片及捕获心肌标志物的方 法，高灵敏度地捕获样本中心肌标志物（抗原）的存在。通过对样本进行预处理和平衡，如 红细胞的去除、pH平衡、本底背景消除，最后获得体系相似的反应体系进入检测室进行目标 捕获，防止包被抗体复溶于流体系统及被流体中抗原捕获脱离包被基材。
[0004] 为达到以上目的，本申请采用免疫磁珠捕获法，实现微流控芯片和基于该芯片的 捕获心肌标志物的方法。免疫磁珠捕获法是一种将磁珠磁场响应能力与免疫特异性相结合 的新型免疫学技术。免疫磁珠具有固相化试剂特质及免疫学反应高灵敏度、高专一性等优 点，在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域广泛应用。利用合成结构含铁，免疫磁珠可 被磁场牵引，其表层具有特异性功能团，可与具有生物活性蛋白进行化学基团的共价结合， 作为抗体承载体。免疫反应中磁珠包被抗体与具有契合决定簇的抗原结合，从血浆等复杂 体系中高效地分离，并且被标记有标识物的抗体所识别定量检测。
[0005] 本发明第一方面提供一种微流控芯片，包括：
[0006] 加样室、Y型结构通道和回收室；
[0007] Y型结构通道分为上部的漏斗状通道和下部的柱形通道；所述漏斗状通道的底部 为免疫标记模块；免疫标记模块上部为滤血模块；
[0008] 下部的柱形通道底端分岔为一对并行的免疫通道；每个免疫通道末端连接一个回 收室；
[0009] 柱形通道设置上下两个腔室，上部腔室为强磁室，下部腔室为质控室。
[0010] 优选的，所述滤血模块为玻纤或无纺布材料。
[0011] 优选的，所述滤血模块以兔抗人红细胞蛋白与凝集素按质量比2:1处理，冻干制 得。
[0012] 优选的，所述滤血模块中间部位还包括结合抗体的免疫磁珠，所述免疫磁珠经过 活化剂活化。
[0013] 优选的，所述微流控芯片强磁室处的底部嵌有强磁片。
[0014] 本发明第二方面提供一种捕获心肌标志物的方法，所述方法应用于上述任一实施 例所述的微流控芯片，所述方法包括：
[0015] 制作包被有能与血液中心肌标志物特异性结合的抗体的免疫磁珠；
[0016] 对所述心肌标志物的对位抗体标记免疫标识物；
[0017] 将包被抗体的免疫磁珠输入所述芯片的滤血模块，将标记对位抗体的免疫标识物 输入免疫标记模块；
[0018] 将一定量心肌标记物样本与平衡液的混合液加至加样室；
[0019] 启动检测设备，反应预设时间，对预定检测项目结果进行检测。
[0020] 优选的，不同的心肌标志物具有不同的磁珠包被体系。
[0021] 优选的，不同的心肌标志物具有不同的标识物；
[0022] 所述标识物包括：量子点、焚光微球和胶体金。
[0023] 优选的，所述心肌标志物包括：心肌肌钙蛋白cTnl、肌红蛋白MY0、C反应蛋白CRP、 心脏型脂肪酸结合蛋白FABP、N端脑钠肽前体NT-proBNP、髓过氧化物酶ΜΡ0。
[0024] 优选的，所述心肌标志物为心肌肌钙蛋白cTnl时，包被抗体的免疫磁珠的制备包 括：
[0025] 免疫磁珠平衡MES缓冲液至所述MES缓冲液的pH为4~5,离子强度为0. 1M;
[0026] 在平衡PH后的溶液中，分别加入EDC和NHS，至EDC与NHS在溶液中的浓度均为 lmg/mL，反应20分钟后离心弃上清；
[0027] 以所述平衡前的MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物；
[0028] 复溶得到的溶液中加入抗体8E10至所述抗体8E10的浓度为0. 5mg/mL;
[0029] 混合包被1小时，加入BSA至所述BSA的浓度为1 %终止反应。
[0030] 优选的，所述心肌标志物为心肌肌钙蛋白cTnl时，所述心肌标志物标记免疫标识 物包括：
[0031] lmg量子点平衡pH为7. 5~8. 5、浓度0. 01M的PBS缓冲液至所述量子点的浓度 为 0·lmg/mL;
[0032] 在平衡后的溶液中，分别加入EDC与NHS，至所述EDC和NHS的浓度均为0. 5mg/mL， 活化30分钟后离心弃上清；
[0033] 以所述平衡前的PBS缓冲液复溶弃上清后的沉淀物；
[0034] 在复溶后的溶液中，加入抗体7G2，标记20分钟，加入BSA至所述BSA的浓度为1 % 终止反应。
[0035] 优选的，所述心肌标志物为肌红蛋白ΜΥ0时，包被抗体的免疫磁珠的制备包括：
[0036] 免疫磁珠平衡PB缓冲液至缓冲液的pH为7~8,离子强度为0. 1M;
[0037] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至所述EDC与NHS的浓度均为lmg/mL，反 应20分钟后离心弃上清；
[0038] 以所述平衡前的PB缓冲液复溶弃上清后沉淀物；
[0039] 在复溶得到的溶液中，加入抗体4E2至所述抗体4E2的浓度为0. 5mg/mL，混合包被 1小时，加入BSA至所述BSA的浓度为1 %终止反应。
[0040] 优选的，所述心肌标志物为肌红蛋白ΜΥ0时，所述心肌标志物标记免疫标识物包 括：
[0041] lmg荧光微球平衡pH为7~9、浓度0. 01M的PBS缓冲液至荧光微球的浓度为 0.lmg/mL；
[0042] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至所述EDC与NHS的浓度均为0. 5mg/mL， 活化30分钟后离心弃上清；
[0043] 以所述平衡前的PBS缓冲液复溶弃上清后的沉淀物；
[0044] 在复溶后的溶液中，加入抗体ΜΥ0,标记20分钟，加入BSA至所述BSA的浓度为1 % 终止反应。
[0045] 优选的，所述心肌标志物为C反应蛋白CRP时，包被抗体的免疫磁珠的制备包括：
[0046] 免疫磁珠平衡MES缓冲液至pH为4. 5~5. 5,离子强度为0. 1M;
[0047] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至所述EDC与NHS的浓度均为lmg/mL，反 应20分钟后离心弃上清；
[0048] 以所述平衡前的MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入抗体CRP135至所述抗体 CRP135在复溶后的溶液中的浓度为0. 5mg/mL;
[0049] 混合包被1小时，加入BSA至所述BSA在复溶后的溶液中的浓度为1 %终止反应。
[0050] 优选的，所述心肌标志物为C反应蛋白CRP时，所述心肌标志物标记免疫标识物包 括：
[0051 ] 40nm胶体金溶液以1(20)3溶液平衡至胶体金溶液pH为8. 5-9. 5 ;
[0052] 在平衡后的溶液中加入抗体CRP36,标记1小时；
[0053] 标记1小时后，在溶液中加入BSA至所述BSA的浓度为1 %终止反应；
[0054] 终止反应后离心，以离子强度为0. 1M、pH为7~9的PBS缓冲液复溶至终止反应 时溶液体积的〇. 1倍。
[0055] 优选的，所述标志物为心脏型脂肪酸结合蛋白FABP时，包被抗体的免疫磁珠的制 备包括：
[0056] 免疫磁珠平衡MES缓冲液至缓冲液pH为4~5，离子强度0. 1M;
[0057] 平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至所述EDC和NHS的浓度均为lmg/mL，反应 20分钟后离心弃上清；
[0058] 以所述平衡前的MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，在复溶后的溶液中加入抗体 FABP5B5至浓度为1.Omg/mL，混合包被1小时，加入BSA至BSA浓度为1 %终止反应。
[0059] 优选的，所述标志物为心脏型脂肪酸结合蛋白FABP时，所述心肌标志物标记免疫 标识物包括：
[0060] lmg量子点平衡pH为7~8、浓度为0· 01M的PBS溶液至量子点浓度为0·lmg/mL;
[0061] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的浓度均为0. 5mg/ mL，活化30分钟后，离心弃上清；
[0062] 将弃上清之后的沉淀物以所述平衡前的PBS溶液复溶，加入抗体FABP28标记20 分钟；
[0063] 加入BSA至所述BSA浓度为1 %终止反应。
[0064] 优选的，所述心肌标志物为N端脑钠肽前体NT-proBNP时，包被抗体的免疫磁珠的 制备包括：
[0065] 免疫磁珠平衡PBS缓冲液至缓冲液的pH为6~7,离子强度为0. 01M;
[0066] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至所述EDC与NHS在溶液中的浓度均为 lmg/mL，反应20分钟后离心弃上清；
[0067] 以所述平衡前的PBS缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入抗体18H5至所述抗体 18H5在复溶后的溶液中的浓度为lmg/mL;
[0068] 混合包被1小时，加入BSA至所述BSA复溶后的溶液中的浓度为1 %终止反应。
[0069] 优选的，所述心肌标志物为N端脑钠肽前体NT-proBNP时，所述心肌标志物标记免 疫标识物包括：
[0070]lmg量子点平衡pH为7. 5-8. 5、浓度为0·01M的PBS缓冲液至量子点的浓度0·lmg/ mL；
[0071] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至所述EDC和NHS的浓度分别为0.5mg/ mL，活化30分钟后离心弃上清；
[0072] 以所述平衡前的PBS缓冲液复溶弃上清之后的沉淀物，加入抗体15F11，标记30分 钟，加入BSA至所述BSA在复溶后的溶液中的浓度为1 %终止反应。
[0073] 优选的，所述心肌标志物为髓过氧化物酶ΜΡ0时，包被抗体的免疫磁珠的制备包 括：
[0074] 免疫磁珠平衡PB缓冲液至溶液pH为7. 5~8. 5,离子强度0· 01M;
[0075] 在平衡后的溶液中分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的浓度均为lmg/ mL，反应20分钟后离心弃上清；
[0076] 以所述平衡前的PB缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，在复溶后的溶