一种含迷迭香酸的凝血酶时间测定试剂的制作方法

文档序号:9666068阅读:575来源:国知局
一种含迷迭香酸的凝血酶时间测定试剂的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为2015104204159的分案申请,申请日为2015-07-16,申请名称 为"一种凝血试剂用抗氧化剂"。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种含迷迭香酸的凝血酶时间测定试剂。
【背景技术】
[0003] 凝血测试属于血栓性疾病检查,其中,凝血酶时间(TT)为凝血功能检查的一个重 要指标,用于检查血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白能力。
[0004] 凝血酶时间测定试剂的核心组份为凝血酶。凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶, 具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列与结构,含A、B两条多肽链,由一个链间二硫键相连。B链 为功能链,具有典型的丝氨酸蛋白水解酶折叠结构,含有1个位于两个β折叠桶之间的活 性中心,2个外结合位点(ExositeI、ExositeII)。凝血酶功能团和三维结构,会因为物 理和化学条件的变化而遭受破坏。
[0005] 凝血酶时间检验是在手动、半自动或全自动凝血仪上进行的,它将诊断试剂与待 测血浆混合,以测定凝血时间。目前,凝血酶时间诊断试剂以干粉制剂为主,因为冷冻干燥 是保护凝血酶蛋白活性的一种有效方法。一般情况下,干粉试剂需要添加定量的复溶液或 去离子水使其复溶,恢复到冻干前的溶液状态,但是,复溶过程耗时,同时,凝血酶的浓度与 冻干前会有差异,如果操作不当,会引起凝血酶变性,导致凝血酶浓度值降低,凝血时间延 长。
[0006] 与干粉状凝血试剂相比,液态凝血酶试剂可克服复溶过程或冻干过程带来的缺 陷,为用户带来使用的便捷,同时也提高了检测结果的准确性和精确性,但是,液体试剂也 给研发者带来了诸多挑战性问题。凝血酶属于生物大分子,它的活性依赖于其自身的精细 空间结构的维系。在液态状态下,蛋白质或酶的结构比较脆弱,酸、碱、温度、离子强度以及 其它某些化合物(包括重价金属离子)的少量存在,都会引起这种空间结构的改变,局部结 构的微小变化也会引起蛋白质或酶活性的丧失。凝血酶的变性或活性的降低,部分是由外 界因素引起的,但在一定条件下,蛋白质或酶也会自分解,导致整体活性下降。因此,需要尽 量消除可能促使蛋白质或酶发生自分解的条件。
[0007] 氧化是导致凝血酶失活或活性降低的重要原因之一,即某些特定的氨基酸残基发 生反应,导致凝血酶功能与结构上变化,对氧化物的亲和力增强,易于聚合、交联而导致其 功能失活。
[0008] 蛋白质类组织中的反应性氧系包括羟基自由基,一般蛋白质和脂质的氧化都是由 自由基链式反应引起,涉及去氢、电子传递、加成、断裂和重排、二聚、歧化和取代,与脂肪氧 化一样,同样包括起始、传递与终止三个阶段。因此,合适的抗氧化剂的加入,可保持液态凝 血酶试剂的稳定性。
[0009] 在制备含抗氧化剂的凝血试剂方面,专利EP942284A2、US5506146、US5314695和 US8729022B2,提出加入氨基酸(主要是甘氨酸)作为抗氧化剂。
[0010] 根据查询的文献资料,凝血试剂中添加的抗氧化剂大概包括3类,一是氨基酸及 其衍生物,以甘氨酸为主要表现形式;二是酸性己糖衍生物,包括抗坏血酸;三是包括丁基 羟基茴香醚和丁基羟基甲苯在内的其它抗氧化剂。
[0011] 在液态凝血酶时间测定试剂中,根据国内外研究文献检索,大多采用多醇或多糖 类或盐酸盐作为凝血酶的稳定剂,同时添加叠氮酸钠作为抗菌剂或稳定剂,这些稳定剂的 选择,基本上遵循了干粉凝血试剂的生产思路,在稳定液态凝血试剂方面,效果并不尽如 意。如前所述,多醇或多糖类物质,能够提升凝血酶的稳定性,但这类物质的过量加入,会增 加混合液的粘度,从而降低采用光学法测定的凝血酶时间测定试剂的准确度,而过量氯酸 盐的加入,会提高溶液相的离子强度。叠氮酸钠具有较好的抗菌性能,但是它的毒性较大。
[0012] 在实验研究的基础上,本发明人发现,在优化传统稳定剂的基础上,添加迷迭香 酸,并合理控制它的加入浓度,会很好地提升液态环境中凝血酶的稳定性。它的加入,会蛰 合溶液相中不利于凝血酶稳定的金属离子,从而降低了二价金属离子对凝血酶氧化反应的 催化作用;同时,也会与过氧自由基发生反应,终止蛋白质过氧化链反应,从而进一步提升 了试剂的稳定性能。
[0013] 在上述研究的基础上,本发明基于抗氧化性的差异和浓度对产物的影响,提出以 含有邻苯二酚结构和相对较小分子量的酚酸作为液态凝血酶试剂的抗氧化剂。更特别的, 选择迷迭香酸作为不同凝血试剂的抗氧化剂,以提升不同凝血试剂的抗氧化性能。

【发明内容】

[0014] 本发明的目的,是在常规凝血试剂的基础上,提出一种高效、无毒的抗氧化剂,它 可以防止凝血试剂中蛋白质的氧化,消除一般抗氧化剂抗氧化性能不足的问题,为凝血试 剂(TT)带来更好的抗氧化性。
[0015] 本发明提出的迷迭香酸属于酚类的一类,按WBSSH的分类,大多数酚类都具有不 同程度的抗氧化性,但并不是所有的酚类都可以用于凝血试剂的抗氧化剂。有研究发现,蛋 白质可以与酚类相互作用,导致蛋白质沉淀[1] [2],另一方面,Asano等[3] [4]认为,含有 脯氨酸残基的蛋白质在与酚类类化合物络合时容易产生沉淀,因为脯氨酸残基或其它疏水 性氨基酸含量高的蛋白质对酚类的亲和力比较强。因此,并不是所有的酚类都可以用于凝 血试剂,尤其是TT测定试剂的抗氧化剂。
[0016] TT测定试剂的主要组成为凝血酶。为了验证酚类对凝血酶活性的影响,本发 明将一定浓度的凝血酶与不同类型的酚类混合,采用发光基物浓度的变化,确定不同类 型的酚类对凝血酶活性的影响。具体地,用Sonder等人[5]提出的方法,测定发光基物 D-Phe-Pip-Arg-pNA的水解程度,以确定人凝血酶的活性,S卩用96孔酶标仪测定415nm处的 吸光度值,每孔中加入发光基物,同时加入与酚类预培养后的人凝血酶。确定各吸光曲线中 最大反应值,并根据曲线估算IC50值,即凝血酶酰胺分解活性抑制50%时对应的酚类的浓 度。
[0017]结果表明,在选择的酚类中,不同的酚类对凝血酶的活性影响不同,添加表儿茶酸 和儿茶酸时,导致人凝血酶活性减少50%时对应的添加浓度较高,介于130-150mM之间;添 加单宁酸时,即使较低的浓度(1. 42mM),也将使人凝血酶的浓度减少50%。丹酚酸或迷迭 香酸对凝血酶活性的影响,受加入浓度的影响,当加入浓度介于0. 01-2mM时,基本不影响 凝血酶的活性,同时提升试剂稳定效果。同时,黄酮类酚类对人凝血酶具有最大的抑制效 果,这与Jedinak[6]和Mozzicafreddo[7]等人的研究结果是吻合的。这一结论,也可以根 据Liu[8]、Li[9]和Shi[10]等人从分子对接方面的研究结果得到验证,他们的研究表明, 在黄酮结构的B环中,-OH基越多,对凝血酶的抑制就越大;黄酮结构的B环与C环,会分别 与凝血酶结构中的S1链袋和S2链袋反应,A环会部分地与凝血酶S3链袋反应,而B环中 的3' -羟基与4' -羟基官能团,以及C环上的其它3' -羟基团,都会抑制凝血酶的活性。
[0018] 本发明在上述实验的基础上,进一步说明,虽然酚类都具有不同程度的抗氧化性, 但并非所有的酚类都可以用于凝血试剂的抗氧化剂或稳定剂。
[0019] 在实验研究的基础上,从抗氧化性相对强弱出发,提出以迷迭香酸作为凝血试剂 的抗氧化剂。
[0020] 本发明的凝血试剂用抗氧化剂,为酚酸,具体为迷迭香酸。
[0021] 本发明所述的迷迭香酸,含有邻苯二酚结构,邻苯二酚结构具有如下的优势:
[0022] 1)邻苯二酚结构具有很强的金属离子蛰合能力,从而降低了二价金属离子对氧化 反应的催化作用,特别地,在制备凝血试剂的过程中,所用原料中的少量重金属离子,会破 坏组织因子或凝血酶的稳定。因此,它起到Η)ΤΑ钠盐或钾盐及部分氨基酸对金属离子的螯 合作用。
[0023] 2)邻苯二酚结构能够与过氧自由基发生反应,从而终止蛋白质氧化或脂质过氧化 链反应,这一点对含有凝血酶的凝血酶时间测定试剂更为重要。
[0024] 另一方面,当酚酸的分子量较大时,会含有较多的酚羟基,这样可以增加酚酸与蛋 白质之间的反应机率,易于形成酚酸(或酚类)_蛋白质的交联网状结构,导致蛋白质不稳 定。因此,本发明在选择酚酸类时,尽量选择分子量较小的含有邻苯二酚结构的酚酸类。同 时,结合实验研究,优选迷迭香酸。
[0025] 本发明优选的迷迭香酸,分子式为C1SH160S,分子量为360。作为天然抗氧化剂,迷 迭香酸具有极强的清除自由基的活性,其抗氧化性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸等。西北轻工 业学食品工程系进行的评价试验证明,迷迭香酸抗氧化剂具有比丁基羟基甲苯更强的抗氧 化作用[11]。根据邹坤[12]等人的研究,迷迭香酸抗氧化作用机理包括直接与活泼自由基 反应,即阻断自由基链的传链过程,从而阻断自由基链式反应;与诱导氧化的过渡金属离子 (包括二价铁离子)络合,达到抗氧化效果。
[0026] 在本发明中,所述迷迭香酸在TT测定试剂中的浓度为0.01_2mM。
[0027] 本发明的目的,是提供一种采用迷迭香酸作为抗氧化剂的TT凝血试剂,由含有 25U/ml人凝血酶、2 %牛血清白蛋白、1. 5mM迷迭香酸、0. 05 %的叠氮酸钠、3. 5 %蛋氨酸、 1. 5%PEG、3%甘露醇、2. 5%麦芽糖和10mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液组成,其中的百分比 均为质量体积比,pH为7. 4。
[0028] 上述含迷迭香酸的凝血酶时间测定试剂的制备方法,步骤如下:配制Tris浓 度50mM、pH7. 4的缓冲液,向该缓冲液中,加入终浓度分别为2%的BSA、1. 5mM迷迭香酸、 0. 05 %的叠氮酸钠、3. 5 %的蛋氨酸、1. 5 %的PEG、3 %的甘露醇、2. 5 %的麦芽糖、10mM的氯 化钙,其中除氯化钙外,其余均为质量体积分数;将上述混合液用0. 22微米滤膜过滤,在滤 液中加入人凝血酶冻干制剂,使终滤液中人凝血酶的浓度为25U/ml,得到TT测定试剂。
[0029]本发明所述迷迭香酸,可以配合其它抗氧化剂共同使用,以进一步提升凝血试剂 的抗氧化能力,改善凝血试剂的稳定性能。所述的其它抗氧化剂包括酸类抗氧化剂如抗坏 血酸,氨基酸类抗氧化剂如甘氨酸、蛋氨酸,这类添加剂的加入量,可按一般凝血试剂中的 加入量添加。
[0030] 由于酚类能够抑制包括丝氨酸蛋白酶在内的许多酶的活性[13],且酚类和蛋白质 能相互作用导致蛋白质沉淀,因此,目前少有将酚类物质用作凝血试剂稳定剂的报道。而本 发明发现,在凝血试剂中加入一种或多种酚类,可显著提升混合液的稳定性。本发明通过抗 自由基活性分析,确定了适合的酚类类型为迷迭香酸;同时,对酚类和凝血酶之间的反应作 了分析,并在此基础上,提出了制备凝血酶时间试剂中迷迭香酸的加入的浓度值。本发明 通过对酚类种类及浓度
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