原花青素的应用及含原花青素的凝血酶时间测定试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及原花青素在凝血酶试剂中的应用，以及一种含有原花青素稳定剂的凝 血酶时间测定试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 用于测定凝血酶时间（TT)的试剂，其中的活性组份为凝血酶。凝血酶是 一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶（CrawleyJT，The centralroleofthrombininhemostasis.JThrombosisHaemostasis2007,5(suppl 1):95 - 101；McMichaelM. ,Newmodelsofhemostasis.TopicsinCompanionAnimal Medicine，2012, 27:40 - 45)。作为活性凝血因子II，它的活性受很多因素的影响，特别 是在液相或乳浊相中。为了维系凝血酶的活性，可添加低浓度的盐类和醇类（USPatent 4696812) ;BSA和EDTA(USPatent4409334);氨基酸类和有机酸及多糖类（特願平 11/272092卜口 >匕、y?安定化手段朽Ar/組成物；USPatent20060246052A1)。含有上 述稳定剂的液相凝血酶制剂，经冷冻干燥制成粉剂后，凝血酶的活性得到较好的保护。另一 方面，根据实验研究，上述添加剂对液态或乳浊相中的凝血酶的稳定效果并不尽理想，特别 是在试剂存放较长时间的条件下。这是由于液态状态下，凝血酶的结构相对粉末态比较脆 弱，酸、碱、温度、离子强度以及其它某些化合物（包括重价金属离子）的少量存在，都会引 起凝血酶空间结构的改变，局部结构的微小变化也会引起凝血酶活性的丧失。
[0003]作为多酷类，黄酮可用于抗菌（Cushnie，T.，Lamb，A.Antimicrobialactivity offlavonoids.InternationalJournalofAntimicrobialAgents2005, 26, 343-356)， 以及抑制肿瘤生长（Ferguson，P.J.，Kurowska，E.M.，Freeman，D.J.Invivoinhibition ofgrowthofhumantumorlinesbyflavonoidfractionsfromcranberry extract，NutritionandCancer2006, 56, 8694)，而更多的研究则倾向于它的抗氧 化性 能(VanAcker,S.A.B.E. ,Structuralaspectsofantioxidantactivityof flavonoids,FreeRadicalBiologyandMedicine1996,20,331-342.；DeSouza,R. F.,Antioxidantpropertiesofcomplexesofflavonoidswithmetalions,Redox Report2004, 9, 97 - 104.；TeixeiraS. ,Structure-propertystudiesonthe antioxidantactivityofflavonoidspresentindiet.FreeRadicalBiologyand Medicine2005,39, 1099-1108)。
[0004] 有研究表明，在含有凝血酶的体系中加入黄酮，凝血酶的活性会受到抑制（Hugo A.Guglielmone,Anticoagulanteffectandactionmechanismofsulphatedflavonoids fromFlaveriabidentis，ThrombosisResearch，2002,2 :183 - 188;LiuL，MaH，Yang N，Aseriesofnaturalflavonoidsasthrombininhibitors:structure-activity relationships.ThrombosisResearsh，2010, 126:365 - 378)D 但是，黄酮包含多个亚类，它 具有较好的抗氧化性，也具有很强的金属离子螯合能力，从而可以降低二价金属离子对物 相氧化反应的催化作用（VanAcker，Influenceofironchelationontheantioxidant activityofflavonoids.Biochem.Pharmacol. 1998, 56:935-943)。基于上述思路，我们发 现并不是所有的黄酮都能够抑制凝血酶的活性，而属于黄酮类的原花青素，不仅不会影响 凝血酶的酰胺反应和蛋白反应，同时还会提升含有凝血酶的液相体系的稳定性能。
[0005] 原花青素主要分布在植物中，包括银杏、大黄、山楂、耳叶番泻、小连翘、葡萄、日本 罗汉柏、北美崖柏、花旗松、白桦树、野生豪4葵、番荔枝、野草莓、海岸松、洋委陵菜、甘薯 等，其中，葡萄籽与松树皮提取物中原花青素的含量最高。
[0006] 原花青素在结构上由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的原花青素 是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体、三聚体、四聚体至十聚体。原花 青素含有很多酚羟基，溶解度较银杏黄酮高，特别是低聚体的溶解性特别好。原花青素为 白色粉末，溶于水、乙醇、甲醇、丙酮，也可溶于乙酸乙脂。它在280nm有强吸收。原花青素 有较强的抗氧化活性，对活性氧有很强的消除能力（KotaT,IncreaseofAntioxidative PotentialofRatPlasmabyOralAdministrationofProanthocyanidin-RichExtract fromGrapeSeeds(J)AgriculturalandFoodChemistry, 1999,45 (5):1892_1897)，摄 入原花青素可提高血浆对氧化应激的抵抗力。同时，酚类消除自由基的能力与化学性 质和立体结构密切相关（SaintCricq,PolyphenolprofilesofFreeheiderapple varieties,JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 1999,47(12):4847-4853)〇
[0007] 本发明在实验研究的基础上，发现在含有凝血酶的试剂中，添加原花青素，可以制 备出较好稳定性的凝血酶时间测定液态试剂。
【发明内容】
[0008] 本发明以原花青素为主要研究对象，分析了原花青素对凝血酶蛋白反应的影响， 提出在含有凝血酶的试剂中，添加原花青素，可以提升凝血酶试剂的稳定性。所得到的含有 凝血酶的试剂，可用于测试凝血酶时间。
[0009] 具体地，本发明采用原花青素用于稳定液相蛋白质，特别用于稳定含有凝血酶的 诊断试剂。
[0010] 所述的原花青素，用于稳定凝血酶时间测定试剂时，所述原花青素的加入量为质 量体积比0. 5-2%，最佳加入量为质量体积比1. 5%。
[0011] 所述的原花青素，当用于凝血酶时间测定试剂中时，不会降低凝血酶的酰胺活性 和蛋白活性，同时会稳定含有凝血酶的乳浊相。
[0012] -种凝血酶时间测定试剂，包含凝血酶5-100U/mL、稳定剂原花青素0. 5-2%。
[0013] 所述的凝血酶时间测定试剂，组分中还可以含有其它稳定剂，包括甘氨酸、氯化 钙、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖、山梨酸钾中的一种或几种。所述其它稳定剂的加入量为甘 氨酸2-3 %、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0. 05-0. 5%、甘露醇2-3%、麦芽糖1-2%、山梨酸钾 0. 5-1%，其中的百分比均为质量体积百分比。
[0014] 所述的含有凝血酶的测定试剂，所述其它稳定剂的加入量优选为：甘氨酸1. 5%、 氯化钙9mM、聚乙二醇0. 1 %、甘露醇2. 3 %、麦芽糖1. 6 %、山梨酸钾1 %，其中的百分比均为 质量体积百分比。
[0015] -种凝血酶时间测定试剂，以20-50mMTris缓冲液为溶剂，包含凝血酶5-100U/ mL、原花青素0. 5-2 %、甘氨酸2-3 %、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0. 05-0. 5 %、甘露醇2-3 %、 麦芽糖1-2%、山梨酸钾0. 5-1%，其中的百分比均为质量体积百分比。
[0016] 优选地，一种凝血酶时间测定试剂，以50mMTris缓冲液为溶剂，包含凝血酶30U/ mL、原花青素1.5%、甘氨酸1.5%、氯化钙9mM、聚乙二醇0. 1%、甘露醇2. 3%、麦芽糖 1.6%、山梨酸钾1%，其中的百分比均为质量体积百分比。
[0017] 所述的含有凝血酶的测定试剂，试剂的pH为7. 1-7. 4,最好为7. 35。
[0018] 上述含有原花青素的凝血酶时间测定试剂的制备方法，过程如下：先配制20_50mM Tris缓冲液，其中含100mM的氯化钠，调节pH值为7. 1-7.4,向该缓冲液中添加甘氨酸 2-3%、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0.05-0. 5%、甘露醇2-3%、麦芽糖1-2%，原花青素 0. 5-2%，将该混合液充分搅拌均匀后，添加凝血酶5-100U/mL，混匀即得液相凝血酶时间测 定试剂。
[0019] 上述含有原花