猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒的制作方法

文档序号:9686012阅读:610来源:国知局
猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒,特别设及一种猪圆环病毒2型竞争化ISA抗体检测试剂 盒,属于免疫学领域。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属 成员,是迄今为止动物病毒中最小的病毒之一,直径为17nm,二十面体对称,无囊膜。病毒基 因组由单股闭合环状DNA组成,含有1766~1769核骨酸(OlveraA,CorteyM,Segal自S J.Molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes:Phylogenyand clonality[J].Virology,2007,357(2):175~185;加angL.P.'LuY.H.'WeiY.W.'et al.Identificationofonecriticalaminoacidthatdeterminesaconformational neutralizingepitopeinthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.BMC Microbiol. 2011a,11:188. )dPCV2基因组主要包含2个大的开放阅读框架(ORFl和0RF2) (CheungAΚ.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2.Virology, 2003,305:168-180. )d0RF1编码复制酶相关蛋白,参与病毒的复制,0RF2编码Cap蛋白,是病 毒的唯一结构蛋白,具有良好的免疫原性,是该病毒诊断方法研制的理想靴抗原化iuC, IharaT,NunoyaT,etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMed Sci. ,2004,66(3) :237~242.)。虽然PCV2只有一个血清型,然而却分为多种基因型,包括 PCV2a、PCV化、PCV2C和PCV2d等。这些基因型的差异使其Cap蛋白抗原性存在差异dPCV2多抗 不能识别这些差异,只有单抗可W区分(SahaD.,HuangL.P.,BussalleuE.,et al.Antigenicsubtypingandepitopes'competitionanalysisofporcine circovirustype2usingmonoclonalantibodies.Vet.Microbiol.2012,157:13-22; HuangL.P.,LuY.H.,WeiY.W.,etal.Identificationofonecriticalaminoacid thatdeterminesaconformationalneutralizingepitopeinthecapsidprotein ofporcinecircovirustype2.BMCMicrobiol.2011a,11:188.)〇
[0003] PCV2是引起临床上发生PMWS疾病的主要病原体,但其致病机制尚未完全阐明。 Meerts等(PeterMeerts,GeraldMisinzo,DavidLefebvre,JensNielsen,Anette Botnet;CharlotteSKristensen,HansJNauwynek.Correlationbetweenthe presenceofneutralizingantibodiesagainstporcinecircovirus2(PCV2)and protectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2-associateddiseased].BMCVetRes2006,2:6-16.)研究表明,猪体内缺乏PCV2中和抗 体与病毒复制能力增强有关,因体内中和抗体效价较化,不能够完全中和体内病毒增殖,最 终发展成为临床raws疾病。为了进一步证实这种观点,Fort等(FortM,01veraA,Sibila Μ,SegalesJ,MateuE:Detectionofneutralizingantibodiesinpostweaning multisystemicwastingsyndrome(PMWS)-affectedandnon-PMWS-affectedpigs[J] .VetMicrobiol2007,125 : 244-255.)进行了系统试验,应用血清中和试验、IPMA和定量PCR检测PMWS猪、没有PMWS表现而PCV2阳性猪W及PCV2阴性猪,结果发现:中和抗体与血清 中病毒载量呈负相关,中和抗体增长的同时病毒数量明显下降;PMWS猪血清中和抗体水平 明显低于没有PMWS表现而PCV2阳性猪。可见中和抗体在清除血液循环中PCV2和疾病康复过 程中发挥重要作用。因此,体液免疫在PCV2相关疾病方面可能占有重要地位。
[0004] 用于PCV2血清抗体检测的方法主要IIF、IPMA、间接化ISA、阻断化ISA、竞争化ISA 和免疫胶体金技术等,其中WIIF和IPMA最为经典和常用,尽管运两种方法具有诸多优点, 但是在结果判定方面存在一定的主观性,难于实现高通量和自动化检测需要使其推广受到 限制。基于重组蛋白建立的间接化ISA具有较好的特异性,但其敏感性低于IPMA(张朝霞, 长明,危艳武,等,猪圆环病毒2型化ISA抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学 报,2008,30(7): 548-551;张志慧,危艳武,吴洪丽,等,猪圆环病毒2型几种化ISA抗体检测 试剂盒的比较与应用[J].中国预防兽医学报,2014,36(2) :129-133),上述几种方法检测结 果不能直接反应PCV2中和抗体。本发明利用PCV2中和性单抗建立的竞争ELISA法可W直接 检测血清中和抗体,具备规模化批量生产的优势,可实现自动化检测要求,特异性强,敏感 性与IPM相当,为该病毒疫苗免疫及临床发病动物血清抗体的检测提供了一种有效手段。

【发明内容】

[0005] 本发明的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒2型竞争化ISA抗体检测试剂盒,该 试剂盒操作简便,特异性好,敏感性高,为PCV2流行病学调查及血清抗体检测提供了 一种有 效技术手段;
[0006] 本发明的第二个目的在于提供一种使用W上所述的试剂盒在制备检测猪血清猪 圆环病毒2型抗体试剂中的应用;
[0007] 本发明的第Ξ个目的在于提供用于建立W上所述试剂盒的单克隆抗体及分泌该 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0008] 为了实现本发明的目的,本发明提供了如下技术方案:
[0009] 本发明W纯化的PCV2作为免疫原,分别对6周龄雌性BALB/c鼠进行3次免疫。首免, 每只鼠注射腹腔50yg(0.5ml)的纯化病毒;间隔3周进行二免,免疫原、剂量和方法同上;再 间隔2周相同方法加强免疫。
[0010] 按常规方法无菌采取免疫鼠脾细胞,用PEG1450进行融合。采用IPMA方法筛选抗 PCV2单抗,具体操作方法参照文献巧IJ长明,张超范,危艳武,等.猪圆环病毒2型免疫过氧化 物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研究与应用[J].中国预防兽医学报,2007,29(8):621 ~6 2 4 .),杂交瘤上清液作为一抗,ΗRP标记的兔抗鼠IgG巧+L)作为检测二抗,经检测,将 IPMA检测为阳性的杂交瘤细胞扩大培养,同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆, 克隆3次,将获得的阳性杂交瘤细胞及时冻存。
[0011] 经IPMA检测筛选,获得1株分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞 株,命名为PCV2-Cap-3A5,分类命名为分泌抗PCV2-Cap-3A5单克隆抗体的杂交瘤细胞株。保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、,地址在北京市朝阳区北辰西路1号 院中科院微生物研究所,其微生物保藏号为:CGMCCNO.10205,保藏时间为2014年12月22 曰。
[0012] 进一步的,本发明还提供了由所述的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0013] 本发明利用得到的单克隆抗体建立了一种猪圆环病毒2型竞争化ISA抗体检测试 剂盒,其特征在于,包括采用间接的捕获包被法包被猪圆环病毒2型抗原的酶标板和酶标记 的抗猪圆环病毒2型化P蛋白单克隆抗体。
[0014] 所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生,所述的杂交瘤细胞株命名为PCV2-Cap-3A5,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、,保藏编号为CGMCC NO.10205。
[0015] 在本发明中,优选的,所述采用间接的捕获包被法包被抗原为先用猪圆环病毒2型 阳性血清包被ELISA板W捕获猪圆环病毒2型抗原;所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2/LG株培 养物,毒价为1Xl〇5TCI化o/ml;所述酶为辣根过氧化酶。
[0016] 在本发明中,优选的,所述猪圆环病毒2型阳性血清的包被稀释倍数为1:1000;所 述捕获猪圆环病毒2型抗原的作用时间为化。
[0017] 在本发明中,优选的,所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、稀释液、显色液、洗 涂液和终止液。
[0018] 在本发明中,优选的,所述阴性对照为猪圆环病毒2型阴性血清;所述阳性对照为 猪圆环病毒2型阳性血清;所述稀释液为含有1%牛血清白蛋白的PBST缓冲液;所述显色液 为ABTS工作液;所述洗涂液为PBST缓冲液;所述终止液为1 %的NaF溶液。
[00
当前第1页1 2 3 4 5 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1