一种抗乙肝病毒HBx单克隆抗体及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学生物工程技术领域，具体设及一种抗乙肝病毒皿X单克隆抗体、用 于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，W及该单克隆抗体 在用于检测样本中皿X的表达和用于制备检测乙型病毒性肝炎、与乙肝相关肝癌样本中皿X 检测，W及病情预后评估的制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 统计资料表明，肝癌术后5年复发率接近60%，肝癌治疗后的复发转移是目前影响 肝癌疗效的重要因素（l.ShermanM.Recurrenceofhepatocellularcarcinoma.NEngl JMed2008;359:2045-2047.)。肝癌复发转移是一个十分复杂的问题，国内外研究发现不 少的癌基因、生长因子和炎症因子等与肝癌细胞侵袭性相关，多种细胞外基质成分也有重 要作用（2.MannCD,NealCP，GarceaG，MansonMM,DennisonAR,BerryDP.Prognostic molecularmarkersinhepatocellularcarcinoma:asystematicreview.EurJ Cancer2007;43:979-992·)，且可能与原发瘤的基因特性有关（3.RoesslerS，JiaHL， BudhuA，ForguesM,YeQH,LeeJS，etal.Auniquemetastasisgenesignature enablespredictionoftumorrelapseinearly-stagehepatocellularcarcinoma patients.CancerRes2010:70:10202-10212.;4.YeQH，QinLX,ForguesM,HeP,Kim JW,PengAC，etal.PredictinghepatitisBvirus-positivemetastatic hepatocellularcarcinomasusinggeneexpressionprofilingandsupervised machinelearning.NatMed2003;9:416-423·)。我国属于肝癌高流行区，全世界半数左右 的肝癌病人集中在我国，流行病学研究表明，乙肝病毒感染与我国肝癌发生密切相关 (5.JemalA,BrayF,CenterMM,FerlayJ,WardE,FormanD.Globalcancer statistics.CACancerJClin2011;61:69-90·)。因此，研究乙型病毒性肝炎背景下肝癌 发生发展的机制显得尤为重要。文献报导，乙肝病毒生活史与宿主细胞密不可分，乙肝病毒 需要依赖宿主细胞才能完成复制；乙肝病毒不但能够整合到宿主细胞基因组，引起插入突 变;而且乙肝病毒表达的蛋白能够与宿主细胞组成成分相互作用，从而干扰宿主细胞的正 常代谢和功能（6.FallotG，NeuveutC，BuendiaMA.DiverserolesofhepatitisB virusinlivercancer.CurrOpinVirol2012;2:467-473.)〇
[0003] 乙型肝炎病毒化BV)属嗜肝DNA病毒科化epadnaviridae)，基因组长约3.化b，为部 分双链环状DNA。其基因组共有四个开放读码框，编码W下一些蛋白：Core蛋白和pre-core 蛋白，Pol蛋白，X蛋白，[^及5蛋白化，M，S)(7.SeegerC,MasonWS.HepatitisBvirus biology.MicrobiolMolBiolRev2000;64:51-68.)。越来越多的研究表明，乙肝病毒X蛋 白化Bx)与肝癌的发生发展密切相关，HBx是一个仅有17kDa的可溶性蛋白，同时存在于细胞 核和胞质。虽然册X不能直接与DNA结合，但是册X在宿主细胞中发挥的作用却十分广泛，参 与调控与细胞生存、稠亡相关的多种基因表达，比如c-jun，c-fos，ASC-2，c-Myc，pUuitary tumor-transforminggene1(PTTGl)等（8.TwuJS,LaiMY,ChenDS,民obinson WS.Activationofprotooncogenec-junbytheXproteinofhepatitisB virus.Virology1993;192:346-350.;9.KalraN,KumarV.TheXproteinofhepatitis BvirusbindstotheFboxproteinSkp2andinhibitstheubiquitinationand proteasomaldegradationofc-Myc.FEBSLett2006;580:431-436.;10.Molina-JimenezF，BenedictoI，MurataM，Martin-VilchezS，SekiT,AntonioPintor-ToroJ, etal.Expressionofpituitarytumor-transforminggene1(PTTGl)/securinin hepatitisBvirus(HBV)-associatedliverdiseases:evidenceforanHBVX protein-mediatedinhibitionofPTTGlubiquitinationand degradation.Hepatology2010;51:777-787.;ll.Kong町，ParkMJ,HongS,Yu町，Lee YC,ChoiYH，etal.HepatitisBvirusXproteinregulatestransactivation activityandproteinstabilityofthecancer-amplifiedtranscription coactivatorASC-2.Hepatology2003:38:1258-1266. )D册X还能促进细胞中转录因子的 活性，比女日AP-1(12.TanakaY，KanaiF,IchimuraT，TateishiK，AsaokaY，GulengB，et al.ThehepatitisBvirusXproteinenhancesAP-1activationthrough interactionwithJabl.Oncogene2006;25:633-642.;13.KekuleAS,LauerU,WeissL, LuberB，HofschneiderPH.HepatitisBvirustransactivatorHBxusesatumour promotersignallingpathway.Nature1993；361:742-745.),NF-kB(14.ChirilloP, FalcoM，PuriPL,ArtiniM，BalsanoC，LevreroM，etal.HepatitisBviruspX activatesNF-kappaB-dependenttranscriptionthrougha民af-independent pathway.JVirol1996;70:641-646.)，androgenreceptor(AR)(15.ChiuCM,YehSH, ChenPJ，KuoTJ,ChangCJ，YangWJ，etal.HepatitisBvirusXproteinenhances 过打droge打receptor-respo打sivegeneexpressiondepe打di打go打过打droge打level.Proc NatlAcadSciUSA2007;104:2571-2578.)，C/EBP(16.ChoiBH'ParkGT'Rho HM.InteractionofhepatitisBviralXproteinandCCAAT/enhancer-binding protein过Iph过synergistic过lly过ctiv过testhehepatitisBvir过1enhancerII/ pregenomicpromoter.JBiolQiem1999;274:2858-2865·)。另一个重要的发现是，册X能 够影响线粒体的钩离子释放，该过程是册V复制所需的关键环节（17.BouchardMJ，Wang LH,Schneider民J.CalciumsignalingbyHBxproteininhepatitisBvirusDNA replication.Science2001:294:2376-2378·)，由于钩离子是多种细胞中一种重要的信号 分子，所^册^成为介导册V与宿主细胞相互作用的关键分子（IS.NassalM.Ca2+:化eclue tohepatitisBvirusXproteinfunction?Hepatology2002；36:755)0
[0004] 综上，册X是册V病毒一