一种蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物样品检测技术领域，具体设及一类蛋氨酸腺巧转移酶生物学活性 测定方法及测定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 除了依靠宿主为生的寄生物W外，所有物种的生物体细胞内都存在蛋氨酸腺巧转 移酶(MethinineAdenos}dtransferase,MAT，EC2.5.1.6)，又称S-腺巧甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethioninesynthetase)dMAT序列具有非常高的保守性，在人类和大肠杆菌之间 MAT的基因序列有59%的同源性。在哺乳类，MAT存在由3个基因编码的立种同工酶，MAT-巧口 MAT-III是由同一个基因（MATla)编码的催化亚基α1组成，MAT-I为四聚体，MAT-III为二聚 体主要存在于成年肝细胞。ΜΑΤ-ΙΙ是由另外一个MAT基因（MAT2a)编码的催化亚基α2组成， 存在于其它细胞，胚胎肝脏和肝癌细胞。ΜΑΤ2β基因编码调节亚基β，主要调节ΜΑΤ-ΙΙdMT在 体内的催化反应分为二步：（1)催化蛋氨酸(Met)和Ξ憐酸腺巧(ATP)生成S-腺巧蛋氨酸(俗 称活化蛋氨酸,S-adenosylmethionine,SAM,AdoMet)和Ξ聚憐酸(PPPi),SAM和PPPi仍然留 在MAT表面上；（2)MAT的憐酸酶活性将把PPPi进一步分解二聚憐酸（PPi)和无机单憐酸 (Pi)〇
[0003] MAT催化心甲硫氨酸或称蛋氨酸化-Met)和Ξ憐酸腺巧(ATP)生成S-腺巧甲硫氨酸 或称S-腺巧蛋氨酸，MAT具有Ξ憐酸酶活性，使Ξ憐酸分解成焦憐酸和憐酸。其酶活性依赖 于Mgh和K+，酶促反应如下：
[0004]
[000引ATP和SAM是生物体内最常见的中间代谢产物。在蛋氨酸循环中，首先必须活化Met,形成SAM，SAM把甲基提供给生命过程中重要物质如DAN，RNA，脂蛋白，激素，神经递质等 后变成同型半脫氨酸化CY)，最后通过四氨叶酸提供的甲基，变成蛋氨酸。在肝脏中，蛋氨酸 循环有个额外的功能，主要是在高蛋氨酸或高蛋白饮食后，用W迅速清除血液中过高的蛋 氨酸，最后通过同型半脫氨酸、半脫氨酸、脫硫酸、谷脫甘肤被转运到其它器官。
[0006]SAM是自然界中仅有的几个功能极其多样而重要的含硫的生物活性物质，是蛋氨 酸循环中的关键物质，是人类至关重要的甲基化修饰过程中甲基的唯一供体。在转甲基、转 硫、转氨丙基反应中有重要的地位。对于甲基化相关的细胞功能、多胺合成、调节蛋氨酸与 同型半脫氨酸的比例等有直接的影响。在各种生命重要的代谢反应和细胞的增殖分化等有 重要意义。依赖于SM的甲基转移酶占人类基因组的基因总数的1%。研究表明，肝脏中维持 一定浓度的SAM对于肝功能的发挥起着至关重要的作用。大约85%的甲基化反应和约50% 的蛋氨酸代谢是在肝脏中进行的，不仅提示肝脏在调节血液蛋氨酸水平有重要的作用(通 过增强MAT-VIII的活性），而且提示SAM在调控肝细胞再生，分化W及对各种因素(酒精，化 学物质，福射，病原微生物，病毒，寄生虫等)造成的肝细胞损伤的敏感性的重大意义。因此 能够精确、敏感、方便地测定MAT在不同情况下的生物活性和产物SAM的含量，对于加深人们 对蛋氨酸循环的深入了解，在不同组织和器官在不同生理和病理情况下的调控关系提供重 要的研究工具。
[0007] 在因肝脏炎症或氧化应激造成的肝损伤中观察到MAT酶部分失活。MATla基因在肝 硬化和肝癌中完全不表达。在MATVIII缺失的小鼠中SAM水平下降;在甘氨酸N-甲基转移酶 (GNMT)缺失的小鼠中，SAM水平上升，运两种情况下，小鼠出现肝癌的几率明显增加。
[0008] 很多研究表明MAT与其催化合成的SAM在人体生命活动的不同阶段，如胚胎发生、 发育、成长、分化、健康、疾病中起着至关重要的作用，就是因为SAM在蛋氨酸循环和一碳代 谢中有非常重要的特殊作用，与人体新陈代谢状况直接相关。体内的SAM含量会因为年龄、 性别、种族、体重、饮食、用药情况、健康和疾病状况而有所波动。鉴于运一特性，我们应该从 SAM的合成和分解代谢两个方面来考察原因。因此，了解MAT在不同情况下生物活性的高低 对于我们研究许多至关重要的代谢与健康问题有很大的实际意义。
[0009] MAT酶活性中屯、有两种构型，第一种构型利于SAM合成，第二种构型具有Ξ憐酸水 解活性。第二种构型的酶反应明显慢于第一种构型的。第一种构型到第二种构型的转换需 要一定的时间。两种构型的差别在于对Ξ憐酸酶和琉基亚硝基化的敏感性。
[0010] 目前有两种办法测定MAT活性:方法一:MAT在饱和底物蛋氨酸，Ξ憐酸腺巧和PPPi 存在条件下，最终生成Pi的。用孔雀绿和钢酸锭直接染色法测定无机憐Pi的含量;方法二： 高压液相化PLC)或质谱化C-MS/MS)方法测定MAT催化合成的产物SAM的量。
[0011] 其中：方法一存在较大的局限性：（1)反应体系中PPPi，PP巧日Pi，共存，孔雀绿和钢 酸锭与PPPi和PPi也有一定的结合，测出的Pi值不准确；（2)灵敏度不高；（3)MT的Ξ憐酸酶 活性需要经过构型转变才能发生，因此测定Ξ憐酸酶的反应产物Pi有滞后效应，迟滞生成 的Pi系间接法，因此变异性高；（4)MAT的Ξ憐酸酶活性受Met影响较大，使得该方法稳定性 受到影响；（5)完全依靠MAT的Ξ憐酸酶活性来推测MAT的SAM合成能力(或活性)本身就有局 限性，因为很有可能MAT的运两种酶活性不成比例，并极有可能不同的MAT酶活性（指SAM合 成能力和PPPi的水解能力)在不同因素作用下表现出不同程度的影响，因而很难用MAT的憐 酸酶水解活性准确地反映MAT的SAM合成活性。
[0012] Fern自ndez-Irigoyen报道不同变异株的MAT-巧日ΜΑΤ-ΙΠ酶活性跟野生型MAT-巧口 MAT-III相比，其Ξ憐酸水解酶活性和SAM合成活性所受的影响各不一致，一些变异株Ξ憐 酸酶活性不变，而SAM合成活性有非常明显的降低;一些变异株SAM合成能力增强而Ξ憐酸 水解酶活性降低;还有一些是两种酶活性不同程度地都降低，总之，各种可能性都会存在。
[0013] SanxhezdelPino等发现MAT-III在121位半脫氨酸残基引入NO基团（亚硝基化）， 使得MAT的SAM和成活性明显降低，而对Ξ憐酸酶活性没有抑制。因此，用测定Pi的方法衡量 MAT活性只能反映SAM合成酶活性W及Ξ憐酸酶活性的总体结果，不能很好地反应MAT的SAM 合成能力，结果很不准确，因而有很大的局限性。
[0014] 那么，Fern自ndez-Irigoyen的报道SAM合成活性是使用上述的方法二，即高压液相 化PLC)方法测定SAM的生成量。其实无论是HPLC或LC-MS/MS哪种方法测定SAM含量，对于评 估MAT活性都是很不准确的。我们知道SAM合成后一段时间都是结合在MAT上的，而HPLC和 LC-MS/MS方法（1)只能测定游离状态的SAM分子；（2)HPLC和LC-MS/MS的样品，需要特殊处 理，经过较长时间、较多步骤后SAM的含量必然有丢失；（3)不能及时测定SAM的量(SAM分子 自身很不稳定，需要及时测定SAM)，所有运些因素都会造成所测的SAM值很不准确，更不用 说试图达到反映酶动力学反应的目的。
[0015] 因此，研发出一种能准确、快速、直接测定蛋氨酸腺巧转移酶生物学活性的检测方 法是非常必要的。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的在于提供一种能准确、快速、直接测定蛋氨酸腺巧转移酶生物学活 性的方法W及利用该方法得到的试剂盒。本发明中设及的一步法或同时法直接测定其合成 的SM产物含量，是MAT活性测定领域的创新。MAT是SAM合成的唯一的酶，无论体内还是体外 方法测定MAT酶活性，本发明都可W最直接地第一时间地快速地测定SAM的含量，W推算MAT 活性的高低，可W同时测定样品中SAM含量和MAT活性。本发明把MAT催化的生化反应与测定 SAM的免疫反应同时进行，把运两个过程有机地结合起来，对于准确地测定分子性状及其不 稳定的SAM尤其具有重大的意义。本发明的创新之处是利用抗S-腺巧蛋氨酸特异性抗体测 定蛋氨酸腺巧转移酶生物学活性。该蛋氨酸腺巧转移酶生物学活性测定方法，有W下部分 组成：（1)在保证蛋氨酸腺巧转移酶有生物学活性的缓冲体系中，含有酶的样品和底物进行 反应W便产生一定量的S-腺巧蛋氨酸产物；（2)利用免疫学方法检测S-腺巧蛋氨酸的含量， 来决定反应体系中蛋氨酸腺巧转移酶是否有活性，W及活性高低。其中：底物含有蛋氨酸， Ξ憐酸腺巧，儀离子和钟离子等适当酸碱性的缓冲体系;样品可W来源于基因工程表达的 产物、生物组织细胞内被纯化出的样品、组织细胞内的蛋氨酸腺巧转移酶，生物体液或组织 细胞培养液，生物体液如血液，血浆，血清，唾液，尿液，脑脊液，腹腔或胸腔渗出液，组织液； 免疫检测方法包含抗S-腺巧蛋氨酸特异性抗体，包括多种示踪物偶联的该抗体，S-腺巧蛋 氨酸或其类似物，和偶联的S-腺巧蛋氨酸或其类似物;蛋氨酸腺巧转移酶的催化反应和所 生成的产物S-腺巧蛋氨酸与包被的S-腺巧蛋氨酸抗原或示踪物标记的S-腺巧蛋氨酸抗原， 竞争结合示踪物标记的抗S-腺巧蛋氨酸抗体或包被的抗S-腺巧蛋氨酸抗体的免疫反应是 基于可W同时进行的一步法原理。
[0017] 为解决现有技术(用孔雀绿和钢酸锭直接染色法测定无机憐Pi的含量;HPLC或LC-MS/MS)方法测定MAT催化合成的产物SAM的量)存在的问题，本发明提供了测定样品中蛋氨 酸腺巧转移酶生物学活性的方法，方案之一包括如下步骤：
[0018] (1)不同浓度标准品的配制:取试剂盒中的S-腺巧蛋氨酸标准品，用缓冲液配制成 不同浓度的标准曲线样品；
[0019] (2)在包被有蛋白（或多聚体)-SAM抗原偶联物或的蛋白（或多聚体)-SAM类似物抗 原偶联物的微孔板中，标准曲线孔中加入配制好的不同浓度梯度的标准品，在待检测样品 孔中加入待检测样品；
[0020] (3)加入辣根过氧化物酶或碱性憐酸酶标记的抗S-腺巧蛋氨酸单克隆抗体，蛋氨 酸、Ξ憐酸腺巧、W及待测蛋氨酸腺巧转移酶的样品，混匀后37°C反应60分钟，反应结束后 洗板；
[0021 ] (4)加入辣根过氧化物酶或碱性憐酸酶的底物，37°C显色15min，加入终止液终止 反应，在酶标仪上选择450nm波长读取每孔的吸光度读数0D450;
[0022] (5)在同一酶联板中用配制的一系列梯度已知量的SAM作为标准品，作为标准曲 线，据其0D450与已知标准品浓度获得曲线方程，再将样本0D450代入方程求得其对应的反 应产物SAM的生成量；
[0023] (6)根据一定质量的含有MAT的样品在单位时间内催化生成产物SAM的浓度来计算 MAT酶活性。
[0024] 所述步骤(2)中的待检测样品可W来源于基因工程表达的样品、生物组织细胞内 被纯化出的样品、生物体液或组织培养液。
[002引所述步骤（3)中37°C反应的时间为20min、30min、40min、50min、60min、70min、 80min、90min。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0027] 1、可W直接测定产物SAM的含量而不是Pi,能直接反映了MAT的合成SAM的能力，不 受MAT构型转变的影响；
[0028] 2、本发明中SAM生成和测定在同一个体系内一步完成，不存在滞后，结果准确及 时；
[0029] 3、用免疫学方法测定SAM，不仅特异