抗-mif的免疫组织化学的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及巨隧细胞移动抑制因子(MIF)的特异性检测，特别是组织中的氧化型 巨隧细胞移动抑制因子(oxMIF)。本发明提供一种使用免疫组织化学的检测方法，其特征在 于使用了特异性的抗-oxMI巧亢体。
【背景技术】
[0002] 巨隧细胞移动抑制因子(MIF)最初是基于其能够抑制对结核菌素非常敏感的豚鼠 (含巨隧细胞）的腹膜渗出细胞在体外随机移动的能力而被分离的细胞因子（Bloom等， Science .，153，80-2( 1966)，David等，PNAS .，56，72-7( 1966))。今天，MIF被认为是天生的和 获得性免疫应答反应的关键的上游调节因子，其可施加一系列多效性的活动。
[0003] 人类MIF的cDNA已于 1989年被克隆（Weiser等，PNAS. ,86,7522-6(1989))，其基因 组被定位于22号染色体上。人类MIF基因的产物是一个含114个氨基酸（切除N端甲硫氨酸 后）、约12.5kDa表观分子量的蛋白质。MIF与其他任何蛋白没有显著的序列同源性。该蛋白 质结晶成相同亚基的Ξ聚体。每个单体包含两个反向平行的α螺旋，α螺旋堆集成有四条链 的0折叠。该单体有另外两个0链，它们与相邻亚基的0折叠相互作用形成单体之间的交界 面。Ξ个亚基排列形成桶，该桶含有溶剂可到达的通道，该通道沿着分子的Ξ折叠轴穿过蛋 白质的中屯、（Sun等，PNAS. ,93,5191-5196(1996))。
[0004] 据报道低浓度的糖皮质激素可m秀导巨隧细胞分泌MIF(Calan化a等，Nature.， 377,68-71 (1995))。然而，MIF也可W反向调节糖皮质激素的效果并且刺激其他细胞因子如 肿瘤坏死因子TNF-a和白介素 IL-Ιβ等的分泌（Baugh等，Crit Care Med，30，S27-35 (2002))"MIF也被证明有如促血管生成，促增生和抗细胞调亡的特性，因此可促进肿瘤细胞 生长（Mitchell，R.A，Cellular Si 即ailing. ,16(1) :p. 13-19(2004) ;Lue，H.等， 化cogene.，26 (35): p. 5046-59 (2007))。其也与如淋己瘤，黑素瘤和结肠瘤的生长直接相关 (Nishihira等，J Interferon Cytokine Res.,20:751-62(2000))。
[0005] MIF是许多疾病状态的中介因子，因此其与多种疾病相关联，包括但不限于炎症性 肠病（I抓），类风湿性关节炎(RA)，急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，哮喘，肾小球肾炎，IgA型肾 病，屯、肌梗死(MI )，脈毒病和癌症。对抗重组人类MIF的多克隆和单克隆抗MI巧亢体已被研发 (Shimizu等，FEBS Lett.,381,199-202(1996);Kawaguchi等，Leukoc.Biol.,39,223-232 (1986);Weiser等，Cell.Immunol.,90,167-78(1958)).
[0006] 有人建议抗MIF抗体用于治疗。Calan化a等(J. Inflamm.，47，39-51 (1995))曾报道 使用抗MIF抗体可W保护动物免于实验诱导的革兰氏阴性和革兰氏阳性的脈毒性休克。抗 MIF抗体也被建议用作一种治疗手段用W调节脈毒性休克和其他炎性疾病状态下细胞因子 的产生。
[0007] US 6645493中公开了来源于杂交瘤细胞的单克隆抗MIF抗体，其抵消了MIF的生物 活性。在动物模型中显示出运些鼠源的抗MIF抗体在处理内毒素引发的休克的治疗上取得 了有益的效果。
[000引 US 200310235584中公开了在动物体内制备MIF高亲和力抗体的方法，该方法中 MIF基因被纯合性地敲除。
[0009] Galat等人描述了糖基化抑制因子（GIF)蛋白化ur. J.Biochem.，224,417-21 (1994)) eMIF和GIF现在被认为是相似的。Wa化rai等（PNAS.，97，13251-6( 1997))描述了与 不同的GIF表位相结合的多克隆抗体W便确定Ts细胞中GIF经翻译后修饰的生物化学本质。 Wa化rai等先前曾报道在体外GIF出现的不同构象同工型。一种异构体是由对单个半脫氨酸 残基进行化学修饰而产生的。该化学修饰导致了 GIF蛋白质的构象改变。
[0010] MIF的水平，即在各种疾病攻击之后，尤其是在炎症性疾病和癌症攻击之后检测到 MIF通常水平会提高。然而，MIF也在健康的个体内循环，其产生了一个明显的区别困难。相 反地，oxMIF不存在于健康对象体内。oxMIF在疾病状态下会增加并且可从病患的采样，如血 液，血清和尿样中被检测到。
[0011] 在对MIF和其抗体的彻底研究之后发现，抗体RAB9、RAB4和RAB0特异性地与oxMIF 结合(不能与redMIF结合）。
[0012] 在发明人早期进行的实验中，证明氧化性的操作步骤如脫氨酸介导氧化，GSSG(氧 化型谷脫甘肤)介导氧化或和Proclin300进行的MIF培养，或蛋白质交联剂(例如BM0E)均会 引发MIF与上述抗体的结合。
[0013] 该发明人推出的令人惊奇的结论是：
[0014] ?重组的MIF(人源、晒齿类源、鼠源、C册细胞源、猴源）的氧化还原调节(脫氨酸/ GSSG介导轻度氧化)或利用Proclin300或蛋白交联剂对重组MIF的处理均会导致其与己克 斯特系抗MIF抗体RAB9，RAB4和RAB0相结合；
[0015] 参oxMIF的减少导致Ab结合的降低；
[0016] ?oxMIF异构体的特异性与体内生物学Ab的功效相关；
[0017] ?oxMIF的水平与疾病状态相关联。
[0018] 关于MIF的其他知识作为本发明人进一步研究的基础。
[0019] 目前，对组织切片中的oxMIF进行检测和染色方法尚不存在。已经知道MIF存在不 同的异构体。天然存在的oxMIF的被认为是一项对与MIF相关的疾病状态的有力和可靠的指 标，通过免疫组织化学下称为IHC)或免疫巧光（IF)方法对其在组织，例如载玻片上的组 织切片的特异性检测受到下述事实的阻碍：当使用标准IHC或IF方法时，oxMIF的结构易受 影响或频繁地完全丢失。
[0020] 因此，明确地需要一种oxMIF异构体的可靠的检测方法。本申请发明人解决了该需 要，而且下文描述的发明实现了该目标。
【发明内容】
[0021] 本发明设及一种用于oxMIF(氧化型巨隧细胞移动抑制因子)检测的检测方法。该 检测方法基于一种免疫组织化学的原理。其在组织样品，尤其是组织切片中使用。
[0022] 优选地，运些组织切片提供在玻璃或塑料载体上，例如玻璃的或塑料的载物片。
[0023] 该方法使用对oxMIF具有特异性的结合抗体。
[0024] 本发明中使用的优选的抗体为单克隆抗体。在特别优选的实施例中，单克隆抗 oxMIF抗体选自由RAB9、RAB0和/或RAB4构成的组，或者选自由RAM9、RAM0和/或RAM4构成的 组，其在下文中将进行详细描述。
[0025] 本发明的优势特异性已通过(参照下文的实施例部分)可利用同型对照抗体(不能 够检测oxMIF因此适合作为阴性对照)或多克隆抗MIF抗体(与全部MIF相结合，由refMIF和 oxMIF构成，适合作为阳性对照）的对照染色表明了本发明有利的特异性，并且其已通过本 申请发明人的其他发现(即oxMIF只能在疾病，例如癌症组织中被检测到)而证实。
[0026] 该检测方法的优选实施例中包含染色步骤。该创造性的检测/染色步骤本身被设 计为用于保存组织切片中的天然oxMIF的结构。目前所知的针对本发明的标准技术手段会 导致MIF向oxMIF的转变，因此会在免疫组织化学技术中产生假阳性染色。
[0027] 本发明具体内容
[0028] 通过下列诸项描述本发明或其一部分：
[0029] 1.-种用于体外检测oxMIF的免疫组织化学（IHC)测定方法，其特征在于，所述 oxMIF为个体组织样品中可与抗体RAB4、RAB9和/或RAB0差异性结合的MIF，其包含用于体外 确定化合物与所述样品中oxMIF结合的步骤。
[0030] 2.项1所述的IHC测定，其特征在于，与oxMIF结合的所述化合物是与oxMIF特异性 结合的抗体。
[0031 ] 3.项2所述的I肥测定，其特征在于，所述抗体与oxMIF结合，而不与redMIF结合。
[0032] 4.项3所述的IHC测定，其特征在于，所述差别性结合是指与oxMIF结合的其Kd值为 lOOnM W下，优选50nM W下，更优选lOnMW下，而不与redMIF结合的特征在于其Kd值为400nM 社。
[003；3] 5 .项2至4所述的IHC测定，其特征在于所述抗体选自由oxMIF连接物，例如抗体 RAB4、RAB9和/或RAB0和/或RAM4、RAM巧口/或RAM0构成的组。
[0034] 6.上述任一项所述的IHC测定，其特征在于，所述样品为组织活体，优选冷冻组织 活体，优选0CT包埋切片，或忍针活组织穿刺。
[0035] 7.上述任一项所述的I肥测定，其特征在于，执行下列步骤中的一步或多步：
[0036] a)利用封闭缓冲液进行的可选封闭步骤和
[0037] b)不进行前述步骤，使用第一抗-oxMIF抗体的结合步骤；
[003引 C)可选的固定步骤；
[0039] d)与第二抗体溫育;和/或
[0040] e)染色
[0041 ] 8.前述任一项所述的IHC测定，其特征在于，在结合步骤之前没有使用有机或无机 固定液，特别是甲醒或丙酬进行固定。
[0042] 9.项7或8所述的IHC测定，其特征在于，在可选的固定步骤之后和/或在第一结合 步骤之前，样品进行空气干燥，优选约30分钟。
[0043] 10.项7-9任一项或多项所述的IHC测定，其特征在于，所述第一抗体是生物素化的 和/或优选地包含在第一稀释缓冲液和/或其中所述第一抗体与样品溫育优选进行45-90分 钟，更优选进行大约60分钟。
[0044] 11.项7-10任一项或多项所述的IHC测定，其特征在于，在溫育步骤d)之后进行清 洗步骤W洗去多余的抗体。
[0045] 12.项7-11任一项或多项所述的IHC测定，其特征在于，所述第二抗体是结合了辣 根过氧化物酶化RP)的链霉亲和素。
[0046] 13.项7-12任一项或多项所述的IHC测定，其特征在于，在溫育步骤d)之后进行清 洗步骤。
[0047] 14.项7-13任一项或多项所述的IHC测定，其特征在于，所述染色步骤使用苏木精 进行。
[0048] 15.上述任一项所述的IHC测定，其特征在于，所述结合步骤使用生物素化的或者 巧光染料标记的结合指示剂进行。
[0049] 16.-种I肥测定盒，适用于执行上述一项或多项所述的方法。
[0050] 上述抗体的不仅可由其自身的基因序列而且通过储存于大肠杆菌化.coli，TGl菌 株)的质粒中进行表征和支持，上述抗体包含上述抗体RAB0、RAB4和/或RAB9 W及RAM0、RAM4 和RAM9中每一个各自的轻链或重链。
[0051] 运些质粒的特征在于它们的DSM编号，其为根据布达佩斯条约在德国微生物菌种 保藏中屯、（DSMZKMascheroder Weg化，Braunschweig,Germany)进行保藏而获得的官方编 号。运些质粒分别保藏在大肠杆菌中。
[0化2] 编号为DSM25110质粒含抗MIF抗体RAB4的轻链序列。
[0化3] 编号为DSM25112质粒含抗MIF抗体RAB4的重链(IgG4)序列。
[0化4] 在适合的宿主细胞中质粒DSM25110和DSM25112的共表达产生优选的抗MIF抗体 RAB4。
[0055] 编号为DSM25111的质粒含抗MIF抗体RAB9的轻链序列。
[0化6] 编号为DSM25113的质粒含抗MIF抗体RAB9的重链(IgG4)序列。
[0化7] 在适合的宿主细胞中质粒DSM25111和DSM25113的共表达产生优选的抗MIF抗体 RAB9。
[0化引编号为DSM25114的质粒含抗MIF抗体RAB0的轻链序列。
[0化9 ] 编号为DSM25115的质粒含抗MIF抗体RAB0的重链(I gG4)序列。
[0060] 在适合的宿主细胞中质粒DSM25114和DSM25115的共表达产生优选的抗MIF抗体 RABOo
[0061 ] 同样被保藏的有抗体RAM0、RAM9和RAM4;均已根据布达佩斯条约在DSMZ保藏(2012 年4月12日于德国布伦瑞克），编号如下：
[0062] RAM9-重链：E.coli GA.662-0l.pRAM9hc-DSM 25860。
[0063] RAM4-轻链:E.coli GA.906-04.pRAM41c-DSM 25861。
[0064] RAM9-轻链：E.coli GA.661-01.pRAM91c-DSM 25859。
[00化]RAM4-重链：E.coli GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
[0066] RAMO-轻链：E.coli GA.906-0l.pRAMOlc-DSM 25863。
[0067]