一种基于荧光共振能量转移技术的血管活性肠肽i型受体抑制剂高通量筛选方法

文档序号:9706715阅读:412来源:国知局
一种基于荧光共振能量转移技术的血管活性肠肽i型受体抑制剂高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域,利用荧光检测技术,构建了血管活性肠肽I型受体抑制剂 的高通量筛选模型,用于待测样品对血管活性肠肽I型受体抑制活性的高通量检测。 技术背景
[0002] 血管活性肠肽I型受体是神经多肽与血管活性肠肽的共同受体,介导多种重要的 生物学功能,如血管活性肠肽I型受体介导神经多肽与血管活性肠肽抑制食欲和抗炎的生 物学功能。血管活性肠肽I型受体在大脑和T细胞大量表达,能够调节神经元分化和T细胞活 化。血管活性肠肽I型受体作为血管活性肠肽受体其中一种亚型,在多种肿瘤细胞表面高水 平表达,而低表达或不表达于正常组织细胞,并在肿瘤的进展和血管生成中发挥重要作用, 是一具潜在应用价值的分子影像诊断和治疗靶标,所以筛选血管活性肠肽I型受体拮抗剂 具有重要应用价值。
[0003] 时间分辨焚光技术(time-resolved fluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕 (Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间 距离小于l〇nm,且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时,则发生荧光共振能量转移,均相 时间分辨焚光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)技术是法国Cisbio公司 利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒), 为了避免短暂的荧光干扰,Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供 体,受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或焚光素修饰,供体在能量转移时就可以使受 体也具有较长的荧光寿命。因此,能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间 成正比,而与供受体间的距离成反比,这种方法延长了荧光检测时间,降低了短暂荧光引起 的背景干扰。
[0004] 实验中利用血管活性肠肽I型受体和Gs蛋白耦联,激活AC,使cAMP含量增加,会产 生带有荧光的产物,通过荧光强弱来判断血管活性肠肽I型受体的作用,从而得出化合物是 否有抑制血管活性肠肽I型受体作用,可以实现对血管活性肠肽I型受体抑制剂的高通量筛 选模型的建立。
[0005] 目前,少有对于血管活性肠肽I型受体抑制剂的筛选方法,因此,建立方便快捷准 确的检测方法,特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于建立一种基于荧光的血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选 模型,具有信噪比高,使用安全,样品消耗量小的特点。
[0007] 本发明的技术方案:采用荧光方法建立体外血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量 筛选模型,初筛,复筛发现一类具有抑制血管活性肠肽I型受体活性的候选化合物。具体步 骤如下:
[0008] 本发明利用荧光的方法建立了一种血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模 型。
[0009] 步骤一:血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0010] 步骤二:阳性药验证模型可靠性。
[0011] 步骤三:高通量筛选模型验证。
【附图说明】:
[0012] 图1:血管活性肠肽I型受体细胞浓度梯度优化实验结果。(n = 1,hs)
[0013] 图2: VIP浓度梯度优化实验结果。(η = 1,;办)
[0014]图3:阳性药VIP(l-7)-GRF(8-27)对血管活性肠肽I型受体的抑制曲线图。 (n=7, x+S)
[0015]
【具体实施方式】
[0016] 以下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】:
[0017] -、血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选方法建立
[0018] 1、实验材料
[0019] d2-cAMP检测试剂盒(Cisbio,法国)、¥1卩(51811^-&1(14。11,美国)、¥1?(1-7)-61^ (8-27)(Sigma-aldrich,美国)、01^]\^85(6让(:〇,美国)384孔聚丙烯微孔板〇3七#3573 (Corning,美国)、一次性枪头(Axygen,美国)
[0020] 2、实验步骤
[0021 ] 1)血管活性肠肽I型受体细胞最适浓度确定
[0022] 1)配制不同浓度的血管活性肠肽I型受体细胞,每孔加入5μ1。
[0023] 2)每孔加入5μ1含VIP的1 X反应buffer。
[0024] 4)室温反应45分钟。
[0025] 5)加入ΙΟμLΧ终止buffer,室温孵育1小时。检测荧光强度,确定最适血管活性肠 肽I型受体细胞浓度(见图2)。
[0026] (2)VIP最适浓度确定
[0027] 1)配制不同浓度的VIP,每孔加入5μ1。
[0028] 2)每孔加入5μ1重悬血管活性肠肽I型受体细胞的1 X反应buffer。
[0029] 4)室温孵育45分钟。
[0030] 5)加入ΙΟμLΧ终止buffer,室温孵育1小时。检测荧光强度,确定最适VIP浓度(见 图1)。
[0031] (3)阳性药(VIP(l-7)-GRF(8-27))IC5〇
[0032] 1)配制不同浓度的VIP(l-7)-GRF(8-27),每孔加入2·5μ1。
[0033] 2)配制最适浓度的VIP,每孔加入2.5μ1(空白对照加5μ1 IX反应buffer)
[0034] 3)配制给定浓度的血管活性肠肽I型受体细胞,每孔加入5μ1。
[0035] 4)室温反应45分钟。
[0036] 5)加入ΙΟμLΧ终止buffer,室温孵育1小时。检测荧光强度,计算得出VIP( 1-7)- GRF(8-27)的 IC5〇(见图3)。
[0037] 2 ·数据处理
[0038] 1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio 665/610);
[0039] 2)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0040]
[0041] 3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值,使用作Graphpad软件作图求算 半数抑制率IC 50。
[0042] 实验结果
[0043] 血管活性肠肽I型受体筛选模型优化结果:最佳反应所需的确定VIP的最适浓度是 236μΜ(见图1),血管活性肠肽I型受体细胞的最适浓度是50〇 cells/well (见图2),阳性药抑 制率IC5Q为2980μΜ(见图3),表明采用本方法建立的血管活性肠肽I型受体抑制剂体外筛选 模型达到了高通量筛选的要求,实验结果稳定可靠,可以用于进行血管活性肠肽I型受体抑 制剂的高通量筛选。
【主权项】
1. 一种血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型,其特征在于,包括步骤: (1) 血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化; (2) 阳性药验证模型可靠性; (3) 高通量筛选模型验证。2. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中进行确定VIP和血管活性肠肽I型 受体细胞最适浓度的实验。3. 如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,配制不同浓度的VIP,每孔加入5μ 1,再每孔加入5μ1含血管活性肠肽I型受体细胞的1X反应buffer,室温孵育45分钟,检测荧 光强度,确定最适VIP浓度为236μΜ;配制不同浓度的血管活性肠肽I型受体细胞,每孔加入5 μL,再每孔加入5μ1含VIP的1X反应buffer,室温孵育45分钟,检测荧光强度,确定最适多血 管活性肠肽I型受体细胞浓度为500cellS/well。4. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)配制不同浓度的阳性药VIP(l-7)_ GRF(8-27),每孔加入2.5μ1,配制最适浓度的VIP,每孔加入5μ1(空白对照加5μ1IX反应 buffer),室温孵育45分钟,检测荧光强度,计算得出阳性药的IC5Q为2980μΜ。5. 权利要求1-5中所述任一所述的方法在筛选血管活性肠肽I型受体抑制剂的应用。
【专利摘要】本发明发现了一种筛选血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选方法,本发明中利用实验中利用血管活性肠肽I型受体和Gs蛋白耦联,激活AC,使cAMP含量增加,会产生带有荧光的产物,通过荧光强弱来判断血管活性肠肽I型受体的作用,从而得出化合物是否有血管活性肠肽I型受体抑制作用。包括以下步骤:(1)血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化:确定VIP和血管活性肠肽I型受体细胞反应的最适浓度;(2)阳性药验证模型可靠性:阳性药IC50与参考文献一致。方法简便快捷;荧光检测值灵敏度高,提高检测精确度;结果稳定可靠,重现性好。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105466897
【申请号】CN201510828140
【发明人】严明, 沈灵, 孙丹丹, 何玲, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年11月20日
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