基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白子分子印迹电化学传感器的制备及应用领域，具体地说是一种基 于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002] 分子印迹技术，是指以某一特定的目标分子(模板分子或印迹分子)为模板，制备 对该分子具有特异选择性聚合物的过程。分子印迹聚合物具有预定性、专一识别性和实用 性，因而被广泛地应用于分离分析、催化以及传感器等分析化学领域。分子印迹电化学传感 器结合电化学传感器和分子印迹技术，以分子印迹聚合物作为生物识别元件来提高电化学 传感器的灵敏度和选择性，目前已被成功用于印迹生物小分子。与此同时，印迹生物大分子 尤其是印迹蛋白质分子，并将其应用于电化学检测引起了研究者们越来越多的关注。但是 印迹蛋白质分子的电化学传感器或生物传感器的灵敏度，由于受到蛋白质分子尺寸大、结 构多变和较低的再键合效率等限制，研究进展缓慢。
[0003] 石墨烯由于比表面积大、电催化性能优异及生物相容性好，因而常被用来作为生 物传感界面来制备性能优良的电化学生物传感器。
[0004] 金属配位技术，金属离子能够特异性地与蛋白质中的某些基团形成配位键，可以 利用蛋白质上的氨基酸残基与金属离子的相互作用来固定更多的模板蛋白质，从而在印迹 电极表面产生更多的印迹识别活性位点，提高其灵敏性。
【发明内容】
[0005] 为解决上述存在的技术问题，本发明提供一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电 化学传感器的制备方法，在石墨稀修饰的玻碳电极上修饰上壳聚糖与金属铜离子的配合 物，通过电聚合法在修饰电极表面制备分子印迹聚合物膜，从而制备具有特异性选择识别 能力的分子印迹电化学修饰电极，提高分子印迹电化学传感器的灵敏度，对模板分子具有 快速、高灵敏性选择识别能力，可以实现临床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在线分析检测。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用的技术解决方案是： 一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，该蛋白质分子印迹电 化学传感器由工作电极、参比电极和对电极组成，所述参比电极设置为饱和甘汞电极，所述 对电极设置为铂丝电极，所述工作电极采用分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE， 所述MIPs-Cu-CS/GR/GCE通过如下步骤制备： (1)壳聚糖-铜离子配合物修饰电极Cu-CS/GR/GCE的制备： 选取玻碳电极，对其进行表面处理，然后取分散好的石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表 面，置于红外灯下烘干，制得石墨烯修饰电极GR/GCE;在得到的GR/GCE表面滴涂壳聚糖-铜 离子CS-Cu溶液，晾干后得到Cu-CS/GR/GCE; (2 )印迹聚合物膜修饰电极Ly ziMIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备： 将步骤(1)得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能单体和交联剂的除氧的磷酸 盐缓冲液中，其中模板蛋白为浓度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能单体为浓度0.05~0.12 mol/L的 甲基丙烯酸，交联剂为浓度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~ 1.2 V电位 范围内，以100 mV/s的扫速循环伏安扫描5圈后取出晾干，得到LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE; (3 )溶菌酶分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备： 将步骤(2)得到的LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入一定浓度洗脱液中，采用循环伏安法在 电压-0.2V~ 1.2V、扫描速率100mV/S进行洗脱，溶菌酶分子Lyz被洗脱出来，得到MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
[0007] 步骤（1)中所述石墨烯为石墨烯本体或经功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的 浓度为 1 mg/mL，取5.0 yL。
[0008] 步骤（1)中所述CS-Cu溶液，是将3 mg/mL壳聚糖乙酸溶液（2%，w/V)中加入0.01 mol/L的CuS04 · 5H20,搅拌均匀使其变成澄清蓝色溶液，即为CS-Cu溶液。
[0009] 步骤(3)中所述洗脱液为硫酸溶液，其浓度为1.0 mol/L。
[0010] 本发明还提供了一种由所述方法制备的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学 传感器的分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
[0011] 本发明还提供了 一种上述分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE在检测 Lyz的应用，将MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入含有Lyz的血浆中培育60 min进行再键合，然后将键 合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到 的印迹电极对不同浓度的模板分子Lyz的电化学响应的线性方程ΔΙ (μΑ) = 38.87 + 3.42 log ayz(g/L)比对，从而得到待测样品中Lyz的含量，其中电化学探针为[Fe(CN)6 ]3_/4_，浓度为 1 mmol/L。
[0012] 本发明制备的分子印迹电化学传感器，利用石墨烯优异的导电性来提高基底电极 的灵敏度，利用金属配位技术，通过壳聚糖、铜离子、模板蛋白质分子间的相互作用，有效增 加了印迹聚合物膜与模板蛋白质分子特异性结合的识别位点，从而提高了印迹电极的灵敏 度和对模板蛋白质分子的选择性，且能够缩短再键合时间，对模板蛋白质分子具有快速、高 灵敏性选择识别能力，应用其可以实现临床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在线分析检测，该制备 过程操作简单，条件温和，适合推广应用。
[0013]【附图说明】： 图1为不同印迹电极在含有1 _〇 1 /L的[Fe (CN) 6 ]3V4^的磷酸盐缓冲液 中的差分脉冲伏安图（pH 7.0)，扫速为100 mV/s，a为MIPs-Cu-CS/GR/GCE，b为MIPs/ GR/GCE〇
[0014]图2为不同印迹电极在含有1 mmol/L的[Fe(CN)6]3V4-的磷酸盐缓冲液中的电化学 阻抗图（pH 7.0)，频率为0.01 - 105 Hz，a为 MIPs-Cu-CS/GR/GCE, b为 MIPs-Cu-CS/GR/ GCE再键合Lyz后，c为 LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE。
[0015] 图 3为[Fe(CN)6]3-/4-在 MIPs-Cu-CS/GR/GCE(a)和 MIPs/GR/GCE(b)上的峰电流随着 再键合时间的变化情况。
[0016] 图4为MIPs-Cu-CS/GR/GCE对1.0 X 10-6 g/L的Lyz，BSA，BHb和Cyt-C的选择性。 [00Π ] 图5为[Fe(CN)6]3-/4-在MIPs-Cu-CS/GR/GCE上的响应电流变化值与Lyz浓度的关 系。
[0018]【具体实施方式】： 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述： 本发明阐述了一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，该蛋白 质分子印迹电化学传感器由工作电极、参比电极和对电极组成，所述参比电极设置为饱和 甘汞电极，所述对电极设置为铂丝电极，所述工作电极采用分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE，所述 MIPs-Cu-CS/GR/GCE 通过如下步骤制备： (1) Cu-CS/GR/GCE的制备 选取玻碳电极，先将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用〇.3 μπι和0.05 μπι Α12〇3粉抛光成镜面，再用二次蒸馏水冲洗玻碳电极表面，并分别置于二次蒸馏水和乙醇 中超声洗涤20s，室温下晾干;取5.0 uL分散好的1 mg/mL石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表 面，置于红外灯下烘干，制得GR/GCE;在得到的GR/GCE表面滴涂5.0 uL分散好的CS-Cu溶液， 晾干后得到Cu-CS/GR/GCE; (2) LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE 的制备 将步骤(1)得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能单体和交联剂的除氧的磷酸 盐缓冲液中，其中模板蛋白为浓度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能单体为浓度0.05~0.12 mol/L的 甲基丙烯酸，交联剂为浓度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~ 1.2 V电位 范围内，以100 mV/s的扫速循环伏安扫描5圈后取出晾干，得到LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE; (3) MIPs-Cu-CS/GR/GCE 的制备 将步骤(2)得到的LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入1.0 mol/L的H2S〇4洗脱液中，采用循环 伏安法在电压-〇. 2V~ 1.2V、扫描速率100mV/S进行洗脱，溶菌酶分子Lyz被洗脱出来，得到 MIPs-Cu-CS/GR/GCE，SP 为工作电极。
[0019] ⑷分子印迹电化学传感器的制备 将步骤(3)得到的MIPs-Cu-CS/GR/GCE作为工作电极，和参比电极、对电极正确连接在 电化学工作站上以组成分子印迹电化学传感器，所述参比电极为饱和氯化钾甘汞电极，对 电极为铂丝电极。
[0020]作为优选的方式，步骤(1)中所述石墨稀为石墨稀本体或经功能化的石墨稀，所述 石墨稀水溶液的浓度为1 mg/mL，取5.0 yL。
[0021 ]作为优选的方式，步骤（1)中所述CS-Cu溶液，是将3 mg/mL壳聚