牛奶中检测黄曲霉毒素m1的免疫层析胶体金试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全领域中涉及免疫胶体金和真菌毒素残留检测领域。具体而 言，本发明涉及一种适用于检测牛奶中黄曲霉毒素 Ml残留的免疫胶体金试纸条。 技术背景
[0002] 黄曲霉毒素 Ml(Aflatoxin Ml)分子式为C17H12O7,属于黄曲霉毒素一类结构相似的 化合物中的一种，该类毒素是由常见的黄曲霉菌（Asperillus Flavus)和寄生曲霉菌 (Asperillus Parasiticus)产生的代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的 机率最高。物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒法破坏。哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素 B1 污染的饲料或食品后，通过羟基化作用转化成黄曲霉毒素 Ml。黄曲霉毒素 Ml危害主要表现 在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。鉴于此，很 多国家已经对牛奶和乳制品中的黄曲霉毒素 Ml含量有了明确的限量标准。
[0003] 牛奶是最古老的天然饮料之一，被誉为"白色血液"，对人体的重要性可想而知。根 据《2013-2017年中国原奶行业投资策略分析》统计当前，我国虽已成为全球第三大原奶生 产国。随着人民生活水平的提高，乳制品消费市场会不断扩大并趋于成熟，对牛奶的质量与 安全有了更新的要求。然而，我国奶业发展面临着一系列新的挑战，其中食品安全问题在一 定程度上严重制约了我国奶业的现代化发展，而黄曲霉毒素 Ml残留是目前最突出的问题之 一。我国将牛奶中黄曲霉毒素 Ml的最低检测标准设定在0.5yg/kg，欧盟将牛奶中黄曲霉毒 素 Ml的最低检测标准设定在0.05yg/kg。
[0004] 目前国际上对黄曲霉毒素的检测技术路线主要有两条:一条是以色(质)谱技术为 核心的化学检测技术，另一条是快速生物检测技术。高效液相色谱法成本高，操作时间长， 步骤多且复杂，因此无法实现真正意义上的现场检测。而胶体金试纸条检测法灵敏度高、特 异性强、稳定性好、操作简便、现场快检测等优点，容易被基层掌握并大面积推广，适合于大 批量样品的现场快速检测，不需要特定的仪器设备，也不需要特定的其他检测试剂，减少了 检测单位的负担，能快速检测获得初步的检测结果，适合我国当前社会经济技术水平，因此 是未来黄曲霉毒素检测的主要发展方向。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种采用一步法间接竞争免疫层析技术快速检测牛奶中 黄曲霉毒素 Ml残留是否符合欧盟限量标准(小于0.05ng/mL)和中国（美国等其他国家)限量 标准（小于〇.5n/mL)的胶体金试纸条。同时，本发明所得到的灵敏度0.05ng/mL是胶体金试 纸条能达到的最下限。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 检测黄曲霉毒素 Ml免疫层析胶体金试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜(NC)、吸水 垫和PVC背衬;硝酸纤维素膜黏附在PVC背衬上，样品垫和吸水垫分别黏附在硝酸纤维素膜 上的两端；
[0008] 硝酸纤维素膜上依次分布样品垫、检测线T1、检测线T2、质控线、吸水垫；
[0009] 检测线Τ1上固定的是1号抗原，浓度为0.15mg/mL;所述1号抗原为:黄曲霉毒素 Β1 与BSA摩尔偶联比25:1偶联物；
[0010] 检测线T2上固定的是2号抗原，浓度为0.8mg/mL;所述2号抗原为:黄曲霉毒素 B1与 BSA摩尔偶联比40:1偶联物；
[0011] 质控线上喷涂的是羊(兔)抗鼠 IgG，浓度为2.5mg/mL;
[0012] 检测线T1和检测线T2的间距是6.5mm，检测线T2和质控线之间的间距分别是 3.5mm；
[0013] 前述的试纸条制成的试纸盒，包括检测黄曲霉毒素 Ml免疫层析胶体金试纸条、及 ELISA孔;所述ELISA孔内包被有黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体-胶体金标记物;检测时将牛奶样 本加入ELISA孔内孵育2分钟后加至试纸条的样本垫上，15分钟后读取实验结果。
[0014] 所述黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法如下：用还原剂将氯金 酸还原成20~40nm的胶体金颗粒;然后把胶体金与抗黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体按体积质量 比1:0.005~0.015混匀，使其结合形成稳定的胶体金颗粒，经纯化和浓缩产生黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体-胶体金标记物;所述还原剂优选为柠檬酸三钠。
[0015] 所述的试纸盒，其制备方法包括如下步骤：
[0016] (1)检测黄曲霉毒素 Ml免疫层析胶体金试纸条：
[0017] 包括样品垫、硝酸纤维素膜(NC)、吸水垫和PVC背衬;硝酸纤维素膜黏附在PVC背衬 上，样品垫和吸水垫分别黏附在硝酸纤维素膜上的两端；
[0018] 硝酸纤维素膜上依次分布样品垫、检测线T1、检测线T2、质控线、吸水垫；
[0019]检测线T1上固定的是1号抗原，浓度为0.15mg/mL;所述1号抗原为:黄曲霉毒素 B1 与BSA摩尔偶联比25:1偶联物；
[0020] 检测线T2上固定的是2号抗原，浓度为0.8mg/mL;所述2号抗原为:黄曲霉毒素 B1与 BSA摩尔偶联比40:1偶联物；
[0021] 质控线上喷涂的是羊(兔)抗鼠 IgG，浓度为2.5mg/mL;
[0022] 检测线T1和检测线T2的间距是6.5mm，检测线T2和质控线之间的间距分别是 3.5mm；
[0023] 将粘好的PVC材料切成一定宽度的试剂条；
[0024] (2)ELISA孔内包被有黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体-胶体金标记物;所述黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法如下：用还原剂将氯金酸还原成20~40nm的胶体 金颗粒;然后把胶体金与抗黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体按体积质量比1:0.005~0.015混匀， 使其结合形成稳定的胶体金颗粒，经纯化和浓缩产生黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体-胶体金标 记物;所述还原剂优选为柠檬酸三钠
[0025] (3)将试纸条、ELISA孔最后组装到一定大小的塑料盒中即可。
[0026] 为了达到更好的技术效果：
[0027] 1号抗原制备：采用EDC活性酷法制备AFBiO-BSA免疫抗原。方法如下：称取I mg EDC溶于0.5mL DMF水中（体积比6:9)标记为1号液，0.8mg NHS溶于0.2mL DMF中，标记为2号 液。先把1号液加到有〇. 6mg AFBiO的EP管中，溶解混匀，再加入2号液23°C避光摇晃（100r/ min)，4h后补加 lmg EDC继续摇晃至24h，使大部分AFBiO生成N-轻琥?自酰亚胺酯，标记为3号 液。取2·56X 10-7mol BSA用Ο· 13mol/L NaHC03，溶解制成Ο·5%的BSA溶液，标记为4号液。把 3号液滴加到4号液中，继续23°C反应24小时。然后收集反应液到处理好的透析袋内， O.lmol/L的PBS中置于4°C透析4天，第1天换透析液3次，以后每天2次。得到AFB^BSA完全抗 原（1号抗原）。
[0028] 2号抗原的制备:方法与AFBi的1号抗原的制备方法一致，区别不同之处在于黄曲 霉毒素 Βι与BSA的摩尔投料比改为40:1。得2号抗原。
[0029]由于黄曲霉毒素 B1与黄曲霉毒素 Ml单抗的结合能力相对较弱，增强了抗原抗体之 间的竞争能力，从而达到T1、T2检测线有规律的阻断。
[0030] 有益效果：
[0031] 本发明的检测牛奶中黄曲霉毒素 Ml免疫胶体金试纸条，采用竞争免疫法，以胶体 金标记黄曲霉毒素 Ml特异单克隆抗体，能够一步检测，同时符合牛奶中黄曲霉毒素 Ml的两 套标准(欧盟和中国），结果准确，无需试剂洗涤和标准对照，能分批或单个样品及时检测。 同时，本专利检测线低，可以达到最低检测限〇.〇5ng/mL。
[0032] 本发明的检测牛奶中黄曲霉毒素 Ml免疫层析胶体金试纸条，使用原材料进行生 产，产品生产流程简单，成本低，检测费用仅为气相/液相色谱的1/5左右，为酶标试剂盒的 1/3。为使用者节省时间，降低因操作步骤冗繁造成的误差，试剂保存时间长、现场操作方便 等优点，可在牛奶中黄曲霉毒素 Ml快速检测及筛查中发挥重要作用。
【附图说明】
[0033]图1黄曲霉毒素 Ml免疫层析胶体金试纸条检测原理图
[0034] 注:A、B、C牛奶中黄曲霉毒素 Ml的浓度分别为:0<(：1〈0.05即/111以欧盟标准）、0.05 < c2〈0.5ng/mL (中国标准）、C3 20.5ng/mL (黄曲霉毒素 Ml残留不符合中国及欧盟的限量标 准）;A、B、C对应的实验结果分别是:T1、T2、C显色;T1、C显色，T2阻断;T1、T2阻断，C显色。 [0035]图2黄曲霉毒素 Ml免疫层析胶体金试纸条结构图
[0036] 图3本发明试纸条对实际加标牛奶样本进行检测
【具体