一种便捷式降钙素原检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种便捷式降钙素原检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 目前定量免疫检测技术中，主要有以下几种定量检测方法：
[0003] -是配套大型、高度集成的自动化仪器的免疫比浊检测技术；
[0004] 二是酶联免疫层析检测技术；
[0005] 三是免疫层析快速检测技术；
[0006] 其中免疫比浊检测技术和酶联免疫检测技术存在样本需要预处理、操作复杂、检 测时间长、需配套复杂的大型仪器、机动性差、出报告时间长等缺点，更适合大批量样本的 集中检测，不适合急诊及各科室门诊、社区医院、小型诊所、急救现场等的快速检测。
[0007] 而免疫层析快速检测技术是近年发达国家发展起来的一种快速免疫分析技术。其 原理是样本液在毛细迀移作用下在硝酸纤维素膜上迀移，其中的待测物与膜上一定区域的 抗体(抗原)结合，通过有色标记物，十几分钟甚至几分钟内即可得到肉眼可见的直观结果。 免疫层析快速检测技术不需将游离的抗体(抗原)和形成复合物的抗体(抗原)进行分离，省 去了繁琐洗涤步骤，因而操作便捷，出报告时间短，在基层医疗机构、急诊、现场、家庭自检 等场所得到了广泛的应用。
[0008] 以胶体金为标记物的第一代免疫层析技术已发展了将近30多年，目前仍广泛应 用，但由于其只能用于定性或半定量的检测，难以满足临床对微量、超微量分析物定量检测 的要求。急需一种能定量快速检测的新技术产品替代胶体金免疫分析产品，满足临床诊断 需求。一些诊断试剂企业开发了能定量检测的荧光免疫检测试剂，但存在抗干扰能力差，使 用不方便等缺点。
[0009] 其中中国国家知识产权局网站上公开了一种降钙素原检测试纸条，采用转换发光 技术，但其检测方法易受类风湿因子和嗜异性抗体的干扰，造成假阳性，而且使用过程需要 对试纸条进行定标，增加了操作复杂性。
[0010] 中国国家知识产权局网站上还公开了一种降钙素原荧光免疫层析法检测试剂盒， 包括PCT反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片，其使用过程为使用者将HS-CRP ID芯 片插入荧光检测仪读取ID芯片数据，然后将样品加入HS-CRP检测缓冲液中反应1分钟，然后 立刻将反应后的HS-CRP检测缓冲液加入HS-CRP反应板加样孔中进行反应，反应结束后插入 荧光检测仪读取荧光信号。其检测过程需读取ID芯片数据和计时反应两次，操作过程复杂， 而且ID芯片无加密功能，容易被复制篡改；而且该方法同样易受类风湿因子和嗜异性抗体 的干扰，造成假阳性。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足，提供一种不易受类风湿因子和嗜 异性抗体的干扰、操作简单的便捷式降钙素原检测试剂盒。
[0012] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种便捷式降钙素原检测 试剂盒，包括试纸条、用于固定试纸条的上卡槽(上壳体)和下卡槽（下壳体）、射频识别芯 片;所述的试纸条包括塑料胶板和塑料胶板上依次设置的样品垫、荧光示踪物标记的降钙 素原第一抗体承载垫、纤维素膜和吸水垫;所述的第一抗体承载垫和吸水垫分别搭接于纤 维素膜的两端;所述样品垫的一端搭接于第一抗体承载垫上;所述样品垫为经过抗人红细 胞抗体溶液处理、具有吸附红细胞作用的样品垫;所述纤维素膜上具有固定降钙素原第二 抗体的检测带T和固定羊抗鼠抗体的质控带C;所述的试纸条置于上卡槽和下卡槽相互拼合 构成的腔体内；所述的上卡槽上对应于样品垫的位置设置有用于添加用样品稀释液稀释后 的目标分析物校准品或待测样本的加样孔(即该加样孔用于添加用样品稀释液稀释后的目 标分析物校准品或用样品稀释液稀释后的待测样本），对应于纤维素膜位置设置有检测窗 口；所述样品稀释液为含有类风湿因子和嗜异性抗体阻断剂的缓冲液;所述的下卡槽靠近 左端设置有射频识别芯片。
[0013] 本发明所述的阻断剂为鼠热处理IgG(将鼠 IgG(小鼠 IgG)置于60-75°C水浴中加热 10分钟即可得到热处理IgG)或商业化阻断剂复合物(如罗氏的MAB33、SCABTIB0D的HBR等）。
[0014] 本发明所述的射频识别芯片用于存储试纸条分析物浓度与荧光信号之间的对应 关系计算方程、测试板生产日期、批号、有效期、参考范围等信息。
[0015] 本发明所述降钙素原第一抗体为能特异性结合降钙素原第一表位的鼠单克隆抗 体(为通过降钙素原抗原免疫小鼠取得的脾细胞与骨髓细胞融合，筛选取得能永久产生降 钙素原第一表位抗体的杂交瘤细胞，并将此杂交瘤细胞培养分离纯化获得目标鼠单克隆抗 体（"能特异性结合降钙素原第一表位的鼠单克隆抗体"获得过程为行业常规技术）。
[0016] 本发明所述降钙素原第二抗体为能特异性结合降钙素原第二表位的鼠单克隆抗 体(为通过降钙素原抗原免疫小鼠取得的脾细胞与骨髓细胞融合，筛选取得能永久产生降 钙素原第二表位抗体的杂交瘤细胞，并将此杂交瘤细胞培养分离纯化获得目标鼠单克隆抗 体)。
[0017] 本发明所述荧光示踪物为能在一定波长激发光源的激发下产生荧光的带有功能 团的有机纳米微球，进一步地，优选带有羧基功能基团的有机荧光微球。
[0018] 本发明所述样本垫为滤纸、玻璃纤维、聚酯纤维、无纺布中的一种。
[0019] 本发明所述纤维素膜为硝酸纤维素膜。
[0020] 本发明所述荧光示踪物标记的降钙素原第一抗体承载垫为滤纸、玻璃纤维、聚酯 纤维、无纺布中的一种。
[0021] 本发明所述吸水垫为滤纸。
[0022] 本发明便捷式降钙素原检测试剂盒的制备方法为：
[0023] 1)荧光示踪物标记的降钙素原第一抗体(荧光抗体)的制备
[0024]用10mmol/L、pH=6.5磷酸盐缓冲液将羧基荧光微球(如东莞市汉诺生物技术有限 公司销售的Carboxylate Microspheres和絲bdt§#Multifluorescent Microspheres中的一种)稀释到浓度为5mg/ml，配制成微球悬液，每10ml上述微球悬液中加 入EDAC(乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，CAS: 25952-53-8) 1~10mg，溶解混匀，室温静置1小 时，lOOOOrpm离心20min，去上清液，然后将沉淀悬浮于等体积的10mmol/L pH=7.2的磷酸 盐缓冲液中，超声分散;然后向羧基微球悬液中加入降钙素原第一表位单克隆抗体(能特异 性结合降钙素原第一表位的鼠单克隆抗体），每10 m 1上述微球悬液中加入抗体1~5 m g，混 合，室温反应2小时，再向上述微球悬液中加入牛血清白蛋白，使得微球悬液中牛血清白蛋 白的浓度为2~20mg/ml，混匀，室温反应1小时；lOOOOrpm离心20min，去上清，沉淀悬浮于等 体积的10mm 〇l/L pH=7.2的磷酸盐缓冲液中，超声分散，4°C保存备用；
[0025] 2)荧光示踪物标记的降钙素原第一抗体承载垫的制备
[0026]用步骤（1)制备的荧光抗体喷涂稀释液稀释荧光抗体到0.5~2mg/ml，在三维喷点 平台上将荧光抗体涂于玻璃纤维垫上，37°C干燥1小时，备用；
[0027] 3)纤维素膜包被抗体的制备
[0028]将硝酸纤维素膜黏贴在PVC塑料胶板中间位置，用抗体包被稀释液分别稀释降钙 素原第二表位单克隆抗体和羊抗鼠抗体到浓度为0.5~2.0mg/ml制备成喷膜液，其中，在三 维喷点平台上喷膜液以条带状喷点在硝酸纤维素膜上适当位置(分别形成固定降钙素原第 二抗体的检测带T和固定羊抗鼠抗体的质控带C)，37°C干燥1小时，备用。
[0029] 4)样品垫的预处理
[0030] 将裁剪好的样品垫置于抗人红细胞抗体溶液中浸泡5分钟，捞出后沥干