一种用于检测白色念珠菌的噬菌体复合纳米线的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，涉及一种用于检测白色念珠菌的噬菌体复合纳米线， 特别涉及具体为一种利用噬菌体展示及纳米技术检测血清Sap2抗体的噬菌体复合纳米线 及应用。
【背景技术】
[0002] 白色念珠菌（Candida albicans)是一种条件致病菌，免疫功能低下的病人容易发 生系统性念珠菌感染（disseminated candidiasis),晚期癌症病人感染率尤其高。中国天 津医科大学癌症研究所的研究表明由于系统性白色念珠菌感染导致的癌症患者死亡率达 到 15. 46%。因此，白色念珠菌感染已经成为导致癌症患者死亡的重要原因之一。用于临床 诊断的血培养缺少灵敏性，病原体检出需要一定时间，难以早期诊断，延误治疗导致患者死 亡率增高。因此，针对癌症患者系统性白色念珠菌感染的诊断对于辅助治疗和延长病人的 存活时间具有重要的意义。
[0003] 白色念珠菌感染早期分泌天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartic proteinases, Sap)，Sap2可作为特异宿主细胞表面蛋白的配体而起作用，能降解多种人体蛋白，引起毛细 血管损伤，去除宿主的防御屏障作用，破坏宿主的补体系统，降解血液中IgA，有助于白色念 珠菌的传播，还能刺激细胞产生多种细胞因子。而且Sap2是一个重要的血清学标志抗原， 患者血清中抗原出现预示感染已经发展成系统性念珠菌感染，循环的Sap2的浓度与感染 的进展程度呈正相关。
[0004] 目前，血清Sap2抗体的检测方法主要是ELISA，该方法操耗时长，假阴性高，且包 被所用的重组Sap2蛋白具有制备繁琐、价格昂贵等缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种用于检测Sap2抗体的噬菌体复合纳米线。
[0006] 本发明所提供的用于检测Sap2抗体的噬菌体复合纳米线，由噬菌体和磁性纳米 颗粒组成；所述嗤菌体展示有Sap2蛋白表位多肽和磁性纳米颗粒结合多肽，所述Sap2蛋白 表位多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述磁性纳米颗粒结合多肽的氨基酸序列 如序列表中序列2所示。
[0007] 在所述噬菌体复合纳米线中，每个所述噬菌体的表面结合29-39个（如34个）所 述磁性纳米颗粒。
[0008] 在所述噬菌体复合纳米线中，所述磁性纳米颗粒为纳米级Fe304，其粒径具体可为 10nm 〇
[0009] 所述噬菌体，具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：
[0010] (al)将所述Sap2蛋白表位多肽的编码基因插入到序列5所示的噬菌体载体的两 个酶切位点Bgl I之间，得到重组载体；将所述磁性纳米颗粒结合多肽的编码基因插入到 所述重组载体的酶切位点Pst I和Hind III之间，得到重组噬菌体载体；
[0011] (a2)将所述重组噬菌体载体转化大肠杆菌（如大肠杆菌MC1061)，得到重组菌；
[0012] (a3)培养所述重组菌，从而获得展示有所述Sap2蛋白表位多肽和所述磁性纳米 颗粒结合多肽的噬菌体。
[0013] 进一步，所述Sap2蛋白表位多肤的编码基因具体为序列表中序列3所7K的DNA分 子；所述磁性纳米颗粒结合多肽的编码基因具体为序列表中序列4所示的DNA分子。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种制备所述噬菌体复合纳米线的方法。
[0015] 本发明所提供的制备所述噬菌体复合纳米线的方法，具体可包括如下步骤：
[0016] (1)按照如上步骤（al)-(a3)，制备得到展示有所述Sap2蛋白表位多肽和所述磁 性纳米颗粒结合多肽的噬菌体；
[0017] (2)将所述磁性纳米颗粒与所述嗤菌体按照100 μ g :4. 8 X 10npfu比例于 20-25°C (如25°C )共同孵育2· 5-3. 5h (如3h)，得到所述噬菌体复合纳米线。
[0018] 其中，将所述磁性纳米颗粒与所述噬菌体共同孵育时的液体环境为TBST。所述 TBST的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HC120mM，NaC1500mM，Tween-20 0.01 %体积分 数；ρΗ7· 5。
[0019] 所述噬菌体复合纳米线在如下（a)-(c)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0020] (a)检测离体哺乳动物血清中Sap2抗体；
[0021] (b)制备检测离体哺乳动物血清中Sap2抗体的试剂盒；
[0022] (c)制备检测哺乳动物是否被白色念珠菌感染的试剂盒。
[0023] 本发明的还一个目的是提供一种用于检测离体哺乳动物血清中Sap2抗体的试剂 盒。
[0024] 本发明所提供的用于检测离体哺乳动物血清中Sap2抗体的试剂盒，可含有所述 噬菌体复合纳米线、洗涤液、洗脱液、终止液和抗所述哺乳动物IgG酶标二抗。
[0025] 本发明的再一个目的是提供一种用于检测或辅助检测哺乳动物是否被白色念珠 菌感染的试剂盒。
[0026] 本发明所提供的用于检测或辅助检测哺乳动物是否被白色念珠菌感染的试剂盒， 可含有所述噬菌体复合纳米线、洗涤液、洗脱液、终止液和抗所述哺乳动物的IgG酶标二 抗。
[0027] 以上所有的所述洗涤液的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCl 20mM， NaC1500mM，Tween-20 0.01 %体积分数；pH7. 5。所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下： 甘氨酸0. 2M ;pH2. 2。所述终止液的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCllM ;pH9. 1。
[0028] 所述试剂盒中还可含有进行ELISA分析所用的常规试剂。
[0029] 进一步，所述试剂盒中还可含有记载有如下内容的说明书：
[0030] (I)取待测哺乳动物的离体血清或所述血清的稀释液，将所述噬菌体复合纳米 线置于所述血清或所述血清的稀释液中孵育lh，所述噬菌体复合纳米线与所述血清中的 Sap2抗体形成复合物；
[0031] 其中，所述离体血清与所述噬菌体复合纳米线的配比可为：血清原液80 μ L :含有 至少6Χ 10、也噬菌体的所述噬菌体复合纳米线。在本发明中，具体为血清10倍稀释液 800 μ L :含有6 X lO'fu噬菌体的所述噬菌体复合纳米线。
[0032] (II)利用磁铁富集所述复合物；
[0033] (III)用所述洗涤液对被富集的所述复合物进行洗涤（如洗涤5次），加入所述洗 脱液静置l〇min，加入所述终止液，用磁铁吸附固定所述磁性纳米颗粒，所述Sap2抗体存在 于澄清液中；
[0034] 其中，加入所述洗脱液的目的是为了使所述Sap2抗体从所述复合物中脱离出来； 加入所述终止液是因为：所述洗脱液是酸性，加入所述终止液终止反应防止对蛋白破坏。
[0035] (IV)采用抗所述哺乳动物IgG酶标二抗对所述澄清液中的所述Sap2抗体进行 ELISA检测，测得0D450,记为0D450实验组；
[0036] 其中，在本发明中，所述"采用抗所述哺乳动物IgG酶标二抗对所述澄清液中的所 述Sap2抗体进行ELISA检测"具体是按照如下步骤进行的：将所述澄清液包被于ELISA板 上，4°C过夜，37°C 200μ 1 5%脱脂奶粉（即5g脱脂奶粉溶于100ml的PBS中）封闭lh， TBST洗脱5次，抗所述哺乳动物IgG酶标二抗37°C孵育lh ;显色后2M H2S04终止反应。
[0037] (V)以未感染白色念珠菌的健康所述哺乳动物的离体血清替代所述待测哺乳动物 的离体血清，按照步骤（I)-(IV)进行操作，测得的0D450记为00450_照组；
[0038] (VI)按照如下确定所述待测哺乳动物是否被白色念珠菌感染：若00450^^大 于00450^^^9 2倍，则所述待测哺乳动物被白色念珠菌感染或候选被白色念珠菌感染；若 大于00450$^^^ 2倍，则所述待测哺乳动物体未被白色念珠菌感染或候选未被 白色念珠菌感染。
[0039] 在本发明中，以上所有的所述哺乳动物均具体可为人或兔子，如人；相应的，所述 抗所述哺乳动物IgG酶标二抗具体为抗人IgG酶标二抗，如山羊抗人IgG辣根过氧化酶标 二抗。
[0040] 实验证明，与现有检测Sap2抗体的ELISA方法相比，本发明具有以下优点：
[0041] 1.通过嗤菌体肽库展示技术，首次将展示Sap2蛋白优势表位和与磁性纳米颗粒 结合颗粒的双展示工程化噬菌体引入到血清检测中，实现Sap2抗体的快速检测。
[0042] 2.本发明利用噬菌体复合纳米线进行Sap2抗体的快速检测，能够大幅度降低血 清Sap2抗体检测成本。
[0043] 3.该噬菌体复合纳米线具有特异性高，检测过程简单，结果准确可靠，方便实现 Sap2抗体检测的临床推广应用。
[0044] 总之，本发明成本低廉，操作简单，检测过程中无需特殊仪器设备，因此能广泛应 用于医院及科学研究，特别适用于农村及基层单位使用。这对白色念珠菌感染的早期发现 具有重要意义。
【附图说明】
[0045]图1为利用噬菌体滴度测定法测定多肽与纳米材料的亲和力结果图。其中，横坐 标所示的各磁性纳米颗粒结合多肽为表1中编号为1-10的10个多肽，以多肽序列的首尾 氨基酸单字母表示多肽名称。
[0046] 图2为SDS-PAGE及Western blot鉴定白色念珠菌Sap2VKYTS表位和与纳米材料 结合多肽的双展示工程化噬菌体的结果。其中，a.为SDS-PAGE结果，1:双展示工程化噬菌 体，2 :pIII展示VKYTS的噬菌体，3 :野生噬菌体。b.为Western blot验证杂合噬菌体，1 : Marker ;2 :白色念珠菌感染血清；3 :健康人血清。
[0047] 图3噬菌体复合纳米线制备图。其中，a.不同滴度双展示工程化噬菌体与100 μ g 磁性纳米材料孵育。b.双展示工程化噬菌体与磁性纳米材料孵育时间图。
[0048] 图4噬菌体复合纳米线敏感性测定结果。其中，a.噬菌体复合纳米线与重组蛋白 对比检测不同稀释倍数人血清Sap2抗体的吸光值。b.噬菌体复合纳米线检测Sap2抗体的 灵敏度。b中横坐标的Anti-Sap2IgG的浓度即为兔源Sap2多克隆抗体稀释液的浓度。
[0049] 图5为本发明噬菌体复合纳米线稳定性检测结果。
【具体实施方式】