一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测重金属离子神离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] ±壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。重金属污染主要指生物毒性显著 地隶、館、領、铅W及类金属神，还包括具有毒性的重金属铜、钻、媒、锡等污染物。随 着城市的扩大和大规模工业的发展，大最重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危 害，通过饮用水，或者通过生物富集W及食物链等方式最终威胁入体健康。承金属污染不同 于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。
[0003] 神的污染，主要来自排放的废水。焦炭、含神黄铁矿床、及其它金属矿场的冲出物； 玻璃器皿制造、木材防腐剂、陶瓷制造业、冶金工业、制革厂、纺织业、染料厂、炼油工业、稀 ±金属工业等都可能排放出含神废水。若此含神废水流入河流中或湖泊中，不仅危害到水 中动植物，亦可能渗透到±壤中，而危害到陆生的动植物。工业上的神污染，也是造成人体 神中毒的祸首。因此，神离子污染已对人类健康构成了严重威胁，建市快速、简便、敏感、特 异、经济、筛检量大的离子锋离子免疫检测技术，对了减少环境污染、提高食品质量、保障食 品安全具有重要意义。
[0004] 所W，痕量重金属的定量分折在食品和环境检测等方而都是非常重要的。传统的 重金属离子检测法如无火焰原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感禪合等离子体质 谱浊、伏安法和离了色谱浊，W及电热原了化原了吸收光谱法等，偷测必须在只各大型分析 仪器的重点实验室内进行，无法用于现场检测，且受到费用高、处理量有限和检测时间长等 限制，郁小利于在生产中推广应用，难W适必环境及市场产品的现场抽查及产品进口快速 通关的要求；免疫学检测方法只有快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，可同时完成高通量 样品的检测，建立免疫分析法检测神离子是生产及经济发展的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗神离子莖合物的高亲 和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，W此为基础提供一种用于检测神离子含量的酶 联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、±壤、水、动物组 织等样品中的神离子的含量。
[0006] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的 sn3++mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、 As3+-DTPA-0VA或As3+-DTPA-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，sn 3+莖合物配置的标准品 稀释液1~9,洗液（PBST)。
[0007] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，用眼观或酶标仪获取结果，并根据结果绘 制标准曲线，添加回归方程式，根据回归方程式分析计算所检测样品中的神离子含量，对神 离子进行痕量分析。
[0008] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，所用的神离子标准品为神离子与邸ΤΑ的 莖合物，莖合物中神离子含量采用石墨炉原子吸收光谱法检测获得莖合物半抗原中Sn的 含量。
[0009] 所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为： A1、双功能整合剂的选择：对氨基苯基-二己Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)，双功能莖 合剂1- (4-异硫氯根苯基）-己二胺四己酸（ITCB巧，2- (4-异硫氯根苯基-1，4, 7,10-四氮 环十二焼四盐酸盐（P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱性或酸性环境下，将离子神离子莖合在双功 能莖合剂上； A2、sn3M)TPA-载体蛋白人工抗原的合成；分别称取鸡卵清白蛋白（0VA)，牛血清白蛋 白度SA)和血藍蛋白化LH) 20mg溶于1血浓度为10mmoL/L，pH9. 0的N-2-居己基脈嗦-N-己 礙酸缓冲液（皿巧中形成KLH、BSA、OVA溶液。称取lOmg金属藝合剂对氨基苯基-二己 Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)溶于1血二甲基亚讽（DMS0)中形成金属藝合剂溶液；分别 取lOOuL金属藝合剂溶液轻轻揽拌下逐滴滴加到0. 5mLKLH和BSA溶液中，用lOmol/LKOH 调节抑至9. 0,室温下反应2地。制备出神离子人工抗原sn3M)TPA-0VA，sn3M)TPA-BSA， sn3+-DTPA-KLH，-20°C保存备用。
[0010] A3、神离子单克隆抗体和多克隆抗体的获得；用sn3M)TPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH免 疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为25 ug/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合 技术制备抗神离子莖合物的单克隆抗体。无菌条件下取免疫鼠脾脏细胞，在聚己二醇PEG-1 500作用下与NS。骨髓瘤细胞进行融合；用间接化I SA法测定细胞上清抗体效价，用阻断 ELI SA法测定上清抗体抑制率，进行阳性孔筛选，用经GF-AAS检测获得sn3+-藝合剂做神 离子标准液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆和扩大培养、通过鉴定， 获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备sn3+mAb ; 多抗制备：用sn3M)TPA-BSA，sn3M)TPA-KLH人工抗原免疫新西兰大白兔，免疫剂量为 50ug~100 ug/次，背部皮下分多点注射或足底注射；首免用弗氏完全佐剂乳化；加强免疫 用弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10~15天，W ELISA 法测其定效价达到1〇5 W上时，采血并分离收集高免血清。W饱和硫酸倭盐析法提取IgG抗 体，-2(TC冻存备用。
[0011] 本发明的检测神离子酶联免疫试剂盒具有下列各项优点： ①特异性强，敏感性高。该检测神离子酶联免疫试剂盒W高亲和力的单克隆抗体（mAb) 或多克隆抗体（pAb)为基础制备而成。酶联免疫试剂盒采用的是非均相间接竞争模式，其 基本原理是样品中的sn3+与过量藝合剂藝合成可溶性的sn 3+-藝合剂复合物后，将其与已包 被于酶标板上的包被抗原sn3+-藝合剂-载体蛋白复合物共同竞争sn 3+mAb上有限的结合位 点，反应达到平衡后洗脱多余的sn3+-藝合剂和sn3+mAb，然后与酶标二抗反应，用酶及其底 物显色系统显示抗原抗体的结合情况，进而定量检测sn3+在样品中的含量。该试剂盒最低 检测限为0. 248 ug/l，检测范围为3. 774~442. 39 ug/l，与其它金属离子交叉反应较小。
[0012] ②简便、快速、时效性强。使用该检测神离子酶联免疫试剂盒，无需其它试剂和仪 器，可现场操作，只要按照该试剂盒说明书上操作步骤进行检测，60分钟内即可判定检测结 果，并根据结果可计算样品中神离子含量。
[0013] ⑨结果显示直观、形象、准确。酶联免疫试剂盒固相上的酶量与标本中受检物质的 量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。显色液和 底物不同显示不同颜色，本试剂盒底物为过氧化脈，显色剂为四甲基联苯胺（TMB)，终止液 为2mol/L的硫酸溶液，故显示藍色，终止后显色为黄色，肉眼可见。与所提供的标准检测液 比较，显色越深则待测物中神离子含量越低或不含，显色越淡或不显色者说明样品中含有 待检物，且含量越高，如有酶标仪可进行度数，度数后根据稀释比例进行计算可得出神离子 的含量。
[0014] ④适用范围广，节省费用，便于推广。使用酶联免疫试剂盒，比用仪器分析的费用 大幅下降。另外，酶联免疫试剂盒的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验， 海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前 景和明显的经济、社会效益。
【附图说明】
[0015] 图1为检测神离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 一种用于检测神离子酶联免疫试剂盒，它包括检测酶标板、用于检测的试剂，其中 试剂包括样品稀释液，样品提取液。重金属离子免疫检测的关键在于重金属特异性单克隆 抗体的制备，重金属特异性单克隆抗体制备的关键又在于重金属免疫原。由于重金属离子 带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒。因此，可利用 特异性的双功能莖合剂莖合重金属离子，形成能被动物免疫系统识别的金属一莖合剂的复 合物，但送些重金属-莖合剂复合物是分子量低于IkD的半抗原，免疫原性低，不足W引起 免疫反应，还需将之与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原。要制成神离子酶联免疫试剂 盒，首先需要对重金属离子神离子与双功能莖合剂进行莖合反应，制备神离子莖合物偶联 载体蛋白，用于制各相应的检测抗体。
[0017] 本发明还包括食品、饲料、饮料、±壤、动物组织等样品预处理方法。饲料、动物 组织±壤等固体样品，研磨捣碎后称取1. Og样品，加入10血肥阳S缓冲液，揽拌30min， 300化/min离必5min，在上清液中加入30mg邸TA，并用化OH溶液调抑至6. 0,室温反应 过夜；市场购买的饮料、自来水等液体样品，取lOmL样品，加入30mg邸TA，用化0H溶液调 抑至6. 0,室温反应过夜，反应后待检。
[0018] 本发明的检测神离子酶联免疫试剂盒，样品处理简单，适合于大量样品的快速检 测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，最低检测限