一种基于荧光共振能量转移技术的前列腺素受体4筛选模型的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了前列腺素受体4拮抗剂的高通量筛选模型，用于待测样品对前列腺素受体4拮抗剂活性的高通量检测。
【背景技术】
[0002]前列腺素受体4(EP4)是一种G蛋白偶联受体，与激活性G蛋白(Gs)偶联，激活后可使细胞内下游cAMP含量上升，广泛参与了细胞代谢的过程。EP4在前列腺素类物质介导的过敏性炎症和免疫性炎症疾病进程中发挥着重要的调节作用。所以建立EP4拮抗剂筛选模型对治疗类风湿性关节炎等疾病具有重要意义。
[0003]cAMP是一种重要的第二信使，介导神经传导递质，荷尔蒙及药物的不同生理应答。胞内cAMP浓度受到两种膜联酶AC和TOE调控，AC活性促进ATP合成cAMP，PDE可将cAMP降解为八10^(:活性受到多种6?0^的调控，6?0^可与两种作用相反的6了?结合蛋白6(^和6的相互作用而产生不同的效应。这些G蛋白是由Ga，Gi3和Gy三种亚基组成的异三聚体分子。激动剂介导的GPCRs激活可导致GTP结合上Ga亚基，引起构象改变，导致三聚体解离成Ga和⑶丫。解离后，Gas主要参与AC的激活，而Gai和《3 γ对AC有抑制作用。测量胞内cAMP是检测待测化合物对于GPCR介导的AC激活或抑制作用的方法。
[0004]cAMP dynamic 2 assay是一种均相时间分辨焚光共振能量转移免疫分析方法，以检测在GPCRs调控下AC活性变化后产生的cAMP。该方法基于d2标记的cAMP示踪剂与样本cAMP竞争结合Eu3+-穴状物标记的cAMP特异性抗体的结合位点。
[0005]当抗体结合了d2-cAMP示踪剂，337nm处的激光可激发Eu3+-穴状物分子，其发出的能量被转移到示踪剂的d2分子上，而发出665nm的荧光，在665nm处的荧光强度随着待测样品中的cAMP含量的增多而减弱，因此信号强度与样品中cAMP浓度成反比。
[0006]对于Ga s耦联的受体，细胞受到激动剂作用而激活会导致c A Μ P水平增加，同时665nm处的荧光强度减弱。加入拮抗剂后该反应逆转，导致信号增强。对于Gai耦联的受体，细胞在AC激动剂Forskol in和激动剂的共同作用下被激活。激动剂可抑制Forskol in诱导的cAMP的产生，因此cAMP-d2信号相对于由Forskolin单独处理的细胞会增加。而拮抗剂会阻滞激动剂的作用，导致cAMP-d2信号的增加。
[0007]时间分辨焚光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨焚光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisb1公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisb1公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或焚光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于建立一种基于荧光的前列腺素受体4拮抗剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0009]本发明的技术方案:首先用含有zeocin的培养基培293cl8/EP4稳转细胞株，培养一段时间后，加入激动剂，反应45min。最后加入d2标记的cAMP示踪剂与样本cAMP竞争结合Eu3+穴状物标记的cAMP特异性抗体的结合位点，反应1小时。最后在Paradigm? Detect1nPlatform检测信号强度评价样品中cAMP浓度，信号与样品中cAMP浓度成浓度依赖。最终实现待测样品对芳香化酶抑制活性的高通量筛选
[0010]本发明利用荧光的方法建立了前列腺素受体4拮抗剂高通量筛选模型。
[0011 ]步骤一:前列腺素受体4拮抗剂筛选模型的建立与优化。
[0012]步骤二:阳性药验证模型可靠性。
[0013]步骤三:高通量筛选模型验证。
【附图说明】
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[0014]图hForskolin作用不同细胞数所产生的信号与标准曲线的对比，结果表示为Mean土SD。
[0015]图2: PGD2可刺激EP4减少cAMP生成且成量效依赖性，结果表示为Mean 土 SD
[0016]图3:L-161982可拮抗PGD2刺激EP4减少cAMP生成且成量效依赖性，结果表示为Mean土SD。
【具体实施方式】
[0017]以下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】:
[0018]—、前列腺素受体4拮抗剂筛选方法建立
[0019]1、实验材料
[0020](1)细胞株:293cl8/EP4
[0021](2)完全培养:DMEM;10%FBS
[0022](3)选择培养:2yL/mL zeocin
[0023](4)Stimulat1n Buffer(SB):含ImM IBMX的DMEM。
[0024](5)主要仪器:CO2培养箱；384孔板；Paradigm? Detect1n Platform
[0025]2、实验步骤
[0026](1)细胞培养
[0027]1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0028]2)弃去培养基后用lmL PBS冲洗细胞一次。
[0029]3)用3mL 0.5mM EDTA消化细胞5min后用3mL培养基终止消化。
[0030]4) lOOOrpm 离心 5min。
[0031 ]5)弃去上清液后用适量培养基重悬细胞，对细胞计数。
[0032]6)用培养基稀释细胞悬液至6mL，使细胞密度达到5 X 105cells/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37°C/5 % C02环境下培养细胞。
[0033]7)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选EP4拮抗剂试验的293cl8/EP4细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用
0.5mM EDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。
[0034](2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
[0035]1)配制cAMP标准稀释液:cAMP标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释为最终浓度的2倍。
[0036]2)配制Forskol in梯度稀释液:需要用Forskol in对细胞进行刺激，所以应将Forskol in储备液逐级稀释为最终浓度的2倍。
[0037]3)配制不同浓度的细胞稀释液:用SB将1.(7)中重悬好的细胞分别稀释为200cells/yL、500cells/yUS800cell