microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域；更具体地，涉及microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前 病变的试剂盒中的应用，为临床上HPV阳性妇女的分流W及宫颈癌或其癌前病变的检测提 供辅助诊断。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全球最常见的女性恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究署 (International Agency for Research on CancerJARC)估计，2008年全球约有52. 9万例 新发宫颈癌，其中85%发生在欠发达地区，59%发生在亚洲；死亡病例达27. 5万，其中85% 死亡病例发生在发展中国家。据中国癌症中必72个肿瘤登记处的数据显示，中国在2009年 登记的宫颈癌发病率为12. 96/10万，且中国宫颈癌的发病正呈年轻化趋势发展（应倩等， "中国2009年宫颈癌发病与死亡分析"中国肿瘤2013,22:612-616)。宫颈癌的高发病率和 年轻化趋势严重影响着中国广大妇女的健康和生活质量，因此对宫颈癌或其癌前病变的早 期诊断和防治意义十分重大。
[0003] 自20世纪40年代W来，己氏涂片开始被广泛用于宫颈癌筛查。宫颈细胞学检查 具有较高的特异性，但其最主要的不足是敏感性低。单次常规己氏涂片对于诊断高级别宫 颈上皮内瘤变（cervical inhaepithelial neoplasia，CIN)的敏感性仅为 50%左右。20 世纪90年代开始发展了液基细胞学（liquid-based ecology, LBC)检查，LBC通过专用设 备实现了液基细胞的薄层制片，提高了宫颈脱落细胞标本的满意率，但对于诊断高级别CIN 的敏感性仍较低，仅为38-65 %，送与常规己氏涂片相比，并无显著差异。
[0004] 德国著名医学科学家Harald zur Hausen早在20世纪70年代研究发现高危型人 乳头状瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的成因。事实上，宫颈癌的发 病一般需要经历从HPV持续感染到不同程度的CIN(CIN1-CIN3)，最后发展成为宫颈癌。送 个过程一般比较漫长，平均需要10-15年时间，送为宫颈癌或其癌前病变的早期发现和阻 断提供了足够的时间。基于高危型HPV与宫颈癌之间存在明确的病因关系，HPV检测已被 欧洲生殖道感染和肿瘤研究组织巧UR0GIN)推荐作为宫颈癌的初筛手段。然而，HPV检测 的最大局限性在于阳性预测值低。有研究表明，近90%的HPV阳性妇女是一过性感染，HPV 会在2年内被机体免疫清除，仅有少数发展为持续感染（de Sanjos6 et al.，"Worldwide prev曰lence 曰nd genotype distribution of cervic曰1 hum曰n p曰pillom曰virus DNA in women with normal cytology:a meta-analysis"Lancet Infect. Dis. 2007,7:453-459)； 而在HPV持续感染的妇女中也仅有少数会最终发生宫颈癌（化bie and化schieri， "Understanding HPV tests and their appropriate applications" Cytopathology 2013,24:289-308)。临床上，HPV检测容易导致阴道镜回叫率和宫颈活检的比例增加，造成 过度诊疗，从而增加了患者的精神压力及随诊费用。因此，选择恰当的方法对HPV初筛阳性 妇女进行合适的分流是有效管理大量HPV初筛阳性妇女的关键。
[0005] microRNA(miRNA)是近年来发现的一类非编码小分子RNA，它能在转录后水平调 控基因的表达，其表达情况与机体众多生理病理状态密切相关。越来越多的研究证据表明， 异常的miRNA表达是人类疾病的标志，包括肿瘤。但遗憾的是，miRNA(特别是宫颈脱落细 胞中的miRNA)检测在宫颈癌或其癌前病变筛查中的应用研究却仍不多。此外，关于新的与 宫颈癌或其癌前病变相关miRNA也有待进一步挖掘。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的 应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供miR-375和/或miR-424的用途，用于制备诊断宫颈癌 或其癌前病变的诊断试剂。
[0008] 在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：
[000引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0010] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[00川在本发明的另一方面，提供特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂的用途，用 于制备诊断宫颈癌或其癌前病变的诊断试剂盒。
[0012] 在一个优选例中，所述的特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂包括：
[001引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0014] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[001引在另一优选例中，所述的特异性扩增miR-424的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:8 和沈Q ID NO: 11所示。
[0016] 在另一优选例中，所述的特异性扩增miR-375的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:9 和沈Q ID NO: 11所示。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种用于诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒，所述试 剂盒中包括：
[001引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0019] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[0020] 在一个优选例中，所述试剂盒中包括特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424 的DM探针，并且，还包括：
[0021] (3)捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于 固相载体上；和
[0022] (4)检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。
[0023] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括选自下组的一种或多种试剂或组件：
[0024] 样品裂解液；
[0025] 洗涂液；
[002引变性液；
[0027] 阴性质控品；
[002引 阳性质控品；
[0029] 鉴定可检测信号的试剂；和/或
[0030] 微孔板。
[0031] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括；特异性扩增miR-218的引物；或特异性 识别（结合）miR-218的探针；较佳地为DNA探针。较佳地，所述的特异性扩增miR-218的 引物的核巧酸序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示。
[0032] 在另一优选例中，所述的可检测信号选自；碱性磯酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖 氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化氨酶或葡萄糖淀粉酶；所述的鉴定可检测信号的 试剂是所述碱性磯酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化 氨酶或葡萄糖淀粉酶的底物。
[0033] 在另一优选例中，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物， 并且，还包括：
[0034] 总RNA提取试剂；
[00对逆转录试剂；
[0036] miR-375 和 / 或 miR-424 逆转录引物；
[0037] miRNA的PCR检测试剂；
[00測 miRNA核酸扩增引物；
[003引阴性质控品；和/或
[0040] 阳性质控品。
[0041] 在本发明的另一方面，提供一种诊断宫颈癌或其癌前病变的方法，所述方法包括： 应用所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中miR-375和/或miR-424的存在 量；较佳地，该方法包括：
[0042] (1)将待测样本裂解后，与所述的特异性识别miR-375和/或miR-424的DNA探针 进行杂交反应，获得杂交液；
[0043] (2)将杂交液加样到包被有捕获抗体的固相载体上，在固相载体上形成捕获抗体 与DNA-RNA杂合体二元复合物；
[0044] (3)将检测抗体加样于固相载体，在固相载体上形成捕获抗体、DNA-RNA杂合体和 检测抗体Η元复合物；
[0045] (4)鉴定固相载体上的可检测信号，确定待测样品中miR-375和/或miR-424的存 在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则提 示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变；
[0046] 或者，所述方法包括：应用所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中 miR-375和/或miR-424的存在量；较佳地，该方法包括：
[0047] (a)提取受试者离体宫颈组织或细胞样本的总RNA ;
[0048] 化）利用miR-375和/或miR-424逆转录引物进行逆转录，获得miR-375和/或 miR-424 的 cDNA ;
[0049] (C)利用特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物进行PCR扩增，确定miR-375 和/或miR-424的存在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或 细胞中的存在量，则提示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
[0050] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】