一种检测三唑醇的试纸条及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明设及Ξ挫醇的检测，具体是一种用于检测Ξ挫醇的胶体金试纸条，其特别 适用于烟液中Ξ挫醇残留的检测。
【背景技术】
[000引立挫醇（triadimenol，Ci边18CN3O2)又名百担，化学名称为1-(4-氯苯氧基)-3,3-二 甲基-1-(1Η-1，2,4-Ξ挫-1-基)-2-下醇，是一种低毒、广谱、高效的内吸性杀菌剂，其主要 作用机理是抑制赤霉素和麦角固醇的生物合成进而影响细胞分裂速率，对烟草根黑腐病、 白粉病、蛙眼病等真菌病害都有很好的防治效果。。因此，在我国农业生产中的应用非常广 泛，适用于麦类、玉米、高梁、果蔬、烟草等农作物。
[0003] 烟草中Ξ挫醇残留是国际烟草科学研究合作中屯、（C0RESTA)密切关注的，且近年 来在我国某些产地烟草中的检出率也较高。随着Ξ挫醇的广泛使用和人们对食品和农作物 安全的重视，Ξ挫醇在食品及农作物中的残留也受到了高度关注。2007年1月欧盟公布了进 口的中国产蜂蜜中检测出Ξ挫醇残留量超标的预警通报。同年5月，日本厚生劳动省查出我 国1批输日胡萝l·中Ξ挫醇残留量超标，由此日方要求对我国出口日本的胡萝l·中Ξ挫醇项 目实施50%监控检查。目前，很多国家已明确限定该农药在食品中的最高残留限量，如日本 规定Ξ挫醇在食品中的残留限量(M化)为0.2~0.5 mg/kg;欧盟规定Ξ挫醇在豆类中的MRL 为0.1 mg/kg;国际食品法典委员会(CAC)规定西红柿中Ξ挫醇的ML为0.5 mg/kg。为避免 Ξ挫醇残留对人体造成危害W及突破国外贸易壁垒，建立简单、快速、准确、可靠的烟草中 Ξ挫醇类残留量的检测方法很有必要。
[0004] 目前常用的Ξ挫醇检测方法主要有气相色谱法化C)、液相色谱法化C)、气-质联用 法化C-MS)和液-质联用法化C-MS)。采用运些分析方法需要昂贵的仪器和专口的技术人员， 样品前处理过程复杂且花费高、费时长，难W满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因 此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成 为迫切需要解决的问题。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于克服现有的检测Ξ挫醇的方法存在的对设备依赖性高，并且不 能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成 本低、不受检测设备限制的试纸条及其制备方法和应用，W实现对大批量的Ξ挫醇样品进 行快速检测和现场监控。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测Ξ挫醇的试纸条，该试纸条包括 样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板;其中，所述反应膜上具有包被有Ξ挫醇 半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上 喷涂有Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物。
[0007] 所述Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物由Ξ挫醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述 载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白，所述Ξ挫醇 半抗原是由Ξ挫酬与氨基己酸在有机碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-締的催化下进行酬胺的 缩合反应得到，其分子结构式为：
[0008] 所述Ξ挫醇单克隆抗体是ΚΞ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获 得，所述羊抗鼠抗抗体是W鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。
[0009] 所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物 释放垫1/3~1/^2被覆盖于样品吸收垫下。
[0010] 所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料;所述样品吸收垫可为吸滤纸或 滤油纸;所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚醋材料;所述吸水垫为吸水纸;所述反应膜可为 硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0011] 一种制备上述试纸条的方法，包括W下步骤： 1) 制备喷涂有Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫； 2) 制备具有包被有Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的 质控线的反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸 条。
[0012] 具体地说，步骤包括： 1) 将Ξ挫酬与氨基己酸在有机碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-締的催化下进行酬胺的缩 合反应，制备Ξ挫醇半抗原； 2) 将Ξ挫醇半抗原与载体蛋白偶联，制备Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物； 3) 用Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、 筛选，得到分泌Ξ挫醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 4) 提取小鼠 IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体； 5) 分别将Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T) 和质控线(C)上； 6) 用巧樣酸Ξ钢与氯金酸反应制备胶体金； 7) 将制备的Ξ挫醇单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到Ξ挫醇单克隆抗体-胶体 金标记物； 8) 将Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37°C烘1 h后取出，置 于干燥环境中保存备用； 9) 将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（质量分数）、pH 7.2的0.1 mol/L憐酸盐缓冲 液浸泡2 h，37°C下烘干2 h; 10) 在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫 从起始端有区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3 mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30 °C条件下可保存12个月。结合物释放垫的被样品吸收垫覆盖可W延长检测结果观察时 间，可使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。
[0013] 应用上述试纸条检测样品中Ξ挫醇的方法，包括如下步骤： (1) 对样品进行前处理； (2) 用试纸条进行检测； (3) 分析检测结果。
[0014] 本发明的检测Ξ挫醇的试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析 技术，将Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的Ξ挫醇在流动 过程中，与结合物释放垫上的Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成Ξ挫醇-抗体-胶 体金标记物。样本中的Ξ挫醇与反应膜检测线上的Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物竞争结 合Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否 含有Ξ挫醇残留。
[0015] 检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当Ξ挫醇在样品中的浓度低于检测限或 为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的Ξ挫醇半抗原-载 体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)处各出现一条红色条带，且T线显色比C线显 色深或与C线显色一致;如果Ξ挫醇在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体 金标记物会与Ξ挫醇全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与Ξ挫醇半抗原-载体蛋白 偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图2所示。
[0016] 阴性：当质控线（C)显示出红色条带，检测线（T)同时也显示出红色条带，且(T)线 颜色接近或深于(C)线时，判为阴性。
[0017] 阳性：当质控线（C)显示出红色条带，而检测线（T)不显色或（T)线颜色浅于(C)线 时，判为阳性。
[0018] 无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该 试纸条均判为无效。
[0019] 本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检 测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测Ξ挫醇 的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
【附图说明】
[0020] 图1为试纸条剖面结构示意图，图中：1、样品吸收垫；2、结合物释放垫;3、反应膜； 4、吸水垫;5、检测线;6、质控线;7、底板； 图2为试纸条检测结果判定图； 图3为Ξ挫醇半抗原合成图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围 内可能会对本发明进行各种改动或修饰，运些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
[0022] 实施例1检测Ξ挫醇的试纸条的制备 该试纸条的制备方法主要包括w下步骤： 1) 制备喷涂有Ξ挫醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫； 2) 制备具有包被有Ξ挫醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的 质控线的反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试 纸条。
[0023] 下面分步详细叙述： 1、Ξ挫醇半抗原的合成(合成路线见附图3)及鉴定 取1.0 gΞ挫酬加乙醇溶解，加入0.35 g 1，8-二氮杂二环^^一碳-7-締(D脚），揽拌，再 加入0.87 g氨基己酸水溶液，