一种基于磁珠分离和dna标记金纳米粒子探针检测atp含量的方法

文档序号:9749225阅读:769来源:国知局
一种基于磁珠分离和dna标记金纳米粒子探针检测atp含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学传感器领域,具体涉及一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒 子探针检测ATP含量的方法。
【背景技术】
[0002] ATP (三磷酸腺苷)是人体细胞内储能、供能的重要物质。ATP是体内重要的能量来 源,是生物体和生命现象的结构基础和功能基础。在物质代谢、机体防御、血液凝固、肌肉收 缩、细胞信息传递、个体生长发育、组织修复等方面发挥着不可替代的作用。当人体遇到强 烈刺激,如病菌侵犯、濒临死亡等严重情况时,ATP会快速转化为二磷酸腺苷,同时释放出巨 大的能量,使机体各系统、各器官迅速获得强大动力。所以,快速测定ATP的含量,是当前生 命分析化学研究的热点问题[Yao W, Wang L, Wang H,et al.An aptamer-based electrochemiluminescent biosensor for ATP detect ion[J]·Bio sensors& Bioelectronics ,2009,24(11) :3269-3274]。文献报道测定ATP的方法有生物发光法 [Branchini B R,Southworth T L,Fontaine D M,et al.An enhanced chimeric firefly luciferase-inspired enzyme for ATP detection and bioluminescence reporter and imaging applications[J] .Analytical Biochemistry,2015:148-153]、电化学法[Bao T, Shu H,ffei ff,et al.A sensitive electrochemical aptasensor for ATP detection based on exonuclease Ill-assisted signal amplification strategy[J].Analytica Chimica Acta,2015,862:64-69]、焚光法[Wang K,Jian L,Yang X,et al .A label-free aptasensor for highly sensitive detection of ATP and thrombin based on metal-enhanced PicoGreen fluorescence[J].Biosensors&Bioelectronics,2015,63c:172-177 ]、酶联吸附分析法[赵秋伶,刘玲玲,杨丽娜.基于核酸适体检测ATP的酶联分析新方法 [J].高等学校化学学报,2014,06:1161-1165]、共振散射光谱法[欧阳辉祥,刘庆业,梁爱 惠,蒋治良.非标记纳米银探针催化共振散射光谱检测痕量ATP[J].化学学报,2011,20 : 2493-2498]等。近年来,基于分子适体的生化分析新方法的研究成为了热点之一 [Shukoor Μ I,Altman Μ 0,Han D,et al.Aptamer-nanoparticle assembly for logic-based detection[J] .Acs Appl Mater Interfaces,2012,4(6) :3007-3011 ·],然而,将核酸适体 技术与结晶紫(CV)适体电化学手段结合对ATP进行检测,至今尚未见文献报道。为了进一步 提高对ATP检测的灵敏度和选择性,采用CV适体电化学信号放大技术,构建了一种高灵敏检 测ATP的电化学新方法,并用于运动前后小鼠心肌ATP含量的测定。在本发明中,利用ATP适 体修饰磁珠为分离载体,以电化学试剂结晶紫适体、CV、ATP适体互补序列修饰的胶体金CV/ DNA2/DNA3/AuNPs为探针,建立了测定ATP电化学新方法,该方法对ATP的测定表现出了高的 灵敏度和良好的选择性。并利用该方法对运动前后小鼠心肌ATP含量进行了测定。

【发明内容】

[0003] 本发明旨在发明一种方法简单、成本低、灵敏度高、选择性好的测定ATP的方法。
[0004] 实现发明目的技术方案是:
[0005] 首先,将羧基化磁珠(MB)与氨基修饰的ATP适体DNA1结合生成MB-DNA1复合物,随 后使得修饰有SH的CV适体DNA2、ATP适体互补链DNA3与纳米金结合,并加入CV生成探针CV/ DNA2/DNA3/AuNPs,然后,MB-DNA1复合物与探针反应,通过DNA1与DNA3结互补作用,生成探 针修饰的磁珠。接着向探针修饰的磁珠溶液中加入含ATP的样品溶液,之后进行磁分离,取 上清液。随后,将上清液滴在金纳米粒子修饰的电极上。将所得到的电极作为工作电极同参 比电极、指示电极插入电解质溶液中,进行电化学测定。由于在电极表面的探针CV/DNA2/ DNA3/AuNPs数量取决于ATP的浓度,因此CV的电化学信号随ATP浓度的增大而增强。根据电 化学信号强弱,实现ATP含量的测定。
[0006] 测定步骤为:
[0007] (1)金纳米粒子的制备
[0008] 制备金纳米粒子所用的玻璃容器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等用王水(浓盐酸 和浓硝酸体积比为1:3)浸泡30分钟,然后用二次水冲洗干净,烘干备用。在250mL圆底烧瓶 中加入100mL,0.01 %的HAuCl4,搅拌加热至沸腾,然后快速加入500yL,1 %的Na3C6H5〇7,再加 热10分钟,搅拌15分钟,冷却至室温。转移在棕色瓶中保存。
[0009] (2)探针 CV/DNA2/DNA3/AuNPs 的制备
[0010] 在 2mL 的离心管中加入 10yL 1.0X10-5M 的 DNA3、30yL 1.0X10-5M 的 DNA2 和 10yL pH 5.2的醋酸缓冲溶液以及1 OyL 1 OmM的TCEP反应lh。随后向其中加入制备好的lmL的 AuNPs溶液,放入摇床轻摇反应16h。使巯基DNA与AuNPs通过Au-S键连接起来,生成DNA2/ DNA3/AuNPs。再向其中加入过量的CV溶液,37°C条件下恒温反应65min,生成探针CV/DNA2/ DNA3/AuNPs〇
[0011] (3)MB-DNA1 的制备
[0012] 取10yL羧基化磁珠至lmL的小离心管管中,并用100yL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶 液清洗两遍,并分散于Tris-HCl缓冲溶液中得磁珠悬浮液。将40mM EDC和10mM NHS加到处 理好的磁珠悬浮液中,将该混合物在室温下轻摇lh。然后,将50yL,5.0 X 10_6M的DNA1加到上 述所得溶液中。在4°C条件下,振动反应12h。反应完成后,将所得产物经过磁性分离,并将得 到的DNA1修饰磁珠产物MB-DNA1分散在lmL pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中。
[0013] (4)ATP 的检测
[0014] 在1.5mL样品管中加入制备好的100yL探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs溶液以及100yL MB-DNA1溶液,反应lh。然后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗三次,并将其分散在lmL pH7.4的 Tris-HCl缓冲溶液中。然后将含有不同浓度的ATP溶液加入,在37°C条件下反应一定时间, 经过磁性分离,取磁性分离清液l〇yL均匀滴涂在工作电极上,室温下静置1小时,然后进行 电化学测定。在室温下将三电极体系放在含有10mM K3[Fe(CN)6]和0.5M KC1溶液中进行表 征。利用差分脉冲伏安法在含0.1M KC1的pH 8.0的磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速扫描, 电位扫描范围为-0.7~0.1 V。
[0015] (5)所使用的仪器与试剂
[0016] CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司);Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上 海市安亭科学仪器厂);Z-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂);PHS-3D型酸度计(上海 雷磁仪器厂);实验采用三电极系统:金电极及修饰金电极为工作电极,Ag/AgCl(饱和KC1) 电极为参比电极,铂丝电极为对电极。
[0017] 浓度为25mg/mL的羧基化磁性纳米颗粒(粒径为100nm)溶液购于阿拉丁试剂有限 公司;TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等购自上海化学试剂有限 公司;EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)购自 Sigma公司;氯金酸(HAuCU),柠檬酸三钠(Na3C6H5〇7)均购于天津市博迪化工有限公司; Tris-HCl缓冲溶液包含lOOmM Tris,0.1%(v/v)Tween 20和 1M NaCl。
[0018] DNA由赛百盛公司合成,序列如下:
[0019] DNA1:5'-NH2-(CH2)6-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3'(ATP适体)。
[0020] DNA2:5'-SH-(CH2)6-TTT TTC CCC CTT TCC CCC TTT CCC CCT TTC CCC C-3'(CV 适体)。
[0021] DNA3:5,-SH-(CH2)6-TCC TTC CTC CGC AAT GTC CCC CCA AAC-3'(ATP适体互补 链)。
[0022] 醋酸缓冲溶液组成:醋酸-醋酸钠溶液。
[0023] 磷酸盐缓冲液组成:磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液。
【附图说明】
[0024]图1测定ATP原理示意图。
[0025]图2 MB-DNA1用量(A),探针用量⑶和ATP与适体结合时间(C)对信号强度的影响。 [0026]图3 ATP浓度与信号关系图。
[0027]图4方法测定ATP的选
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1