、c为掺杂不同摩尔比例Eu和Tb的二氧化硅荧光纳米探针的发射光谱，其中a为(Eu: Tb = 1:3)，b(Eu: Tb = 1:1)，c (Eu: Tb = 3:1)，但这种混合包裹的焚光纳米探针，随着在外层的“layer-by-layer”包裹，其特征光谱峰也没有发生变化，并且由于硅壳层有一定的厚度，使得层与层之间有一定的距离，从而保证TEOS纳米内的Eu3+和/或Tb3+离子不会产生荧光自猝灭效应，保证了荧光强度会随着层数的增多而增强。这样带来最直接的好处就在于危害因子检出限相比于传统技术得到了显著的提高，检测灵敏度增加，检测结果更加准确和具有针对性，这对于后续的标记实验是重要的，这样可以保证不同类型的荧光纳米探针混合进行多种危害因子的同步检测，并有望实现可视化检测。
[0105]在实际应用过程中，牛奶中还可能存在其他的危害因子，这类危害因子分子量较小，如三聚氰胺、黄曲霉毒素、Beta-内酰胺类抗生素等，其仅具有一个位点，也称为半抗原，由于这类危害因子的结构和特性的限制，不能采用“夹心法”法进行检测，而必须采用“竞争法”进行检测。
[0106]当待检物不仅有细菌、病毒类大分子危害因子，还有细菌的代谢产物、次生代谢产物、抗生素等其他小分子危害因子时，检测方法大致分为两种。
[0107]方法一，本方法是预先将待检测的溶液加入到检测通道内，然后再将含有多种荧光纳米探针的容易加入到检测通道内进行检测。
[0108]在这种情况下，对于细菌、病毒类大分子危害因子，采用“夹心法”进行检测，该检测通道内和用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面均固定有该危害因子的捕获抗体；具体举例来说明:若待检物中需要检测肠出血性大肠杆菌0157: H7，则微流控芯片中某一条或两条检测通道内固定肠出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体，并且荧光纳米探针溶液中有表面偶联肠出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体的荧光纳米探针，形成抗体-抗原-抗体的三明治结构，通过检测荧光信号即可得到待检物中的肠出血性大肠杆菌0157:H7的含量。
[0109]对于如细菌的代谢产物、次生代谢产物、抗生素等小分子危害因子，采用“竞争法”进行检测，该检测通道内固定有该危害因子的捕获抗体，且用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面固定有该危害因子的模拟物;具体举例来说明:若待检物中需要检测三聚氰胺，则微流控芯片中某一条或两条检测通道内固定三聚氰胺的单克隆抗体，并且荧光纳米探针溶液中有表面偶联BSA-三聚氰胺的荧光纳米探针，在测试过程中，三聚氰胺先被检测通道内的三聚氰胺的单克隆抗体捕获，此时，检测通道内的三聚氰胺的单克隆抗体还有部分处于未捕获三聚氰胺的状态，此时加入荧光纳米探针溶液，未捕获三聚氰胺的单克隆抗体继续与表面偶联BSA-三聚氰胺的荧光纳米探针结合，通过检测荧光信号即可得到待检物中的三聚氰胺的含量。
[0110]方法二、本方法是预先将多种荧光纳米探针加入到待检测的溶液中混合，然后在微流控芯片的检测通道内进行检测。
[0111]在这种情况下，对应检测的细菌、病毒类大分子危害因子，采用“夹心法”进行检测，该检测通道内和用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面均固定有该危害因子的捕获抗体，具体如方法一中大分子危害因子的检测方法。在此不再重复论述。
[0112]对于如细菌的代谢产物、次生代谢产物、抗生素等小分子危害因子，采用“竞争法”进行检测，该检测通道内固定有该危害因子的模拟物，且用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面固定有该危害因子的捕获抗体;具体举例来说明:若待检物中需要检测三聚氰胺，则微流控芯片中某一条或两条检测通道内固定BSA-三聚氰胺，并且荧光纳米探针溶液中有表面偶联三聚氰胺单克隆抗体的荧光纳米探针，在测试过程中，三聚氰胺先被荧光纳米探针溶液的具有三聚氰胺单克隆抗体的荧光纳米探针捕获，此时，还有部分三聚氰胺单克隆抗体的荧光纳米探针处于未捕获三聚氰胺的状态，此时将混合溶液加入到检测通道中，未捕获三聚氰胺的荧光纳米探针继续与检测通道内的BSA-三聚氰胺结合，通过检测荧光信号即可得到待检物中的三聚氰胺的含量。
[0113]在荧光检测过程中，采用“竞争法”进行检测的检测通道会显示荧光。如果荧光越强烈，代表样品中如细菌的代谢产物、次生代谢产物、抗生素或其他小分子物质类危害因子越少，甚至于无该类危害因子。
[0114]采用“夹心法”法进行检测的检测通道会显示荧光。如果荧光越强烈，代表样品中细菌、病毒类危害因子越多。
[0115]“夹心法”检测法和“竞争法”检测法在荧光数据上是截然相反的体现，“夹心法”检测法所检出的荧光强度越大，则代表对应的危害因子的浓度越高，“竞争法”检测法所检出的荧光强度越小，则代表对应的危害因子的浓度越高。
[0116]通过上述的操作，可以实现同一样品中多种危害因子同时进行检测，检出限低，检测精度高，操作简单。
[0117]以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种荧光纳米探针，包括内部载有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS纳米内核，其特征在于:所述的TEOS纳米内核表面修饰有多层表面键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS壳层。2.根据权利要求1所述的荧光纳米探针，其特征在于，所述的TEOS纳米内核的表面也键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。3.根据权利要求1所述的荧光纳米探针，其特征在于，所述的稀土螯合物所用的螯合剂为BBCAP或BHHCT或PTTA，所述的表面键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS壳层为3?5层。4.一种如权利要求1至3任一所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤1:在反相微乳液中合成内部载有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核； 步骤2:在TEOS纳米内核的表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物； 步骤3:在键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核表面修饰一层TEOS壳层； 步骤4:在步骤3得到的具有TEOS壳层的粒子表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物； 步骤5:重复步骤3和步骤4，2?4次； 步骤6:在步骤5得到的粒子表面修饰一层TEOS壳层。5.根据权利要求4所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于:所述的步骤2具体为:将步骤I所得到的TEOS纳米内核置于无水乙醇中并加入APTMS反应，得到表面键合有氨基的TEOS纳米内核，并将其置于无水乙醇中； 然后加入螯合剂，使螯合剂和氨基反应，将反应产物经过Tris.HCl溶液处理后置于无水乙醇中； 最后加入EuCl3和/或TbCl3,反应一段时间后得到表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核。6.根据权利要求5所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于:所述的步骤3具体为:将步骤2得到的TEOS纳米内核置于无水乙醇溶液中并加入TEOS反应，使TEOS聚合反应得到修饰有一层TEOS壳层的粒子； 所述的步骤4具体为:将步骤3得到的具有TEOS壳层的粒子置于无水乙醇溶液中并加入APTMS反应，使TEOS壳层的表面键合氨基；然后加入螯合剂，使螯合剂和氨基反应，经过Tris.HCl溶液处理后置于无水乙醇中，最后加入EuCl3和/或TbCl3,反应一段时间后使TEOS壳层的表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。7.—种用于食品中多种危害因子同步检测的方法，其特征在于:所述的方法通过具有多条检测通道的微流控芯片和多种如权利要求1至3任一所述的荧光纳米探针实施； 所述的方法具体为:将待检物溶液加入到多条检测通道后，用缓冲液冲洗后加入含多种荧光纳米探针的溶液，最后用缓冲液冲洗后检测检测通道内的荧光信号； 其中，对于采用夹心法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内和用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面均固定有该危害因子的捕获抗体； 对于采用竞争法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内固定有该危害因子的捕获抗体，且用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面偶联有该危害因子的模拟物。8.—种用于食品中多种危害因子同步检测的方法，其特征在于:所述的方法通过具有多条检测通道的微流控芯片和多种如权利要求1至3任一所述的荧光纳米探针实施； 所述的方法具体为:首先将含多种荧光纳米探针的溶液与待检物溶液混合后，将混合溶液加入到多条检测通道中，然后用缓冲液冲洗后检测检测通道内的荧光信号； 其中，对于采用夹心法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内和用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面均固定有该危害因子的捕获抗体； 对于采用竞争法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内固定有该危害因子的模拟物，且用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面偶联有该危害因子的捕获抗体。9.根据权利要求7或8所述的用于食品中多种危害因子同步检测的方法，其特征在于:所述的模拟物为危害因子与BSA的复合物，或危害因子与卵清蛋白的复合物。10.根据权利要求7或8所述的用于食品中多种危害因子同步检测的方法，其特征在于:所述的微流控芯片上还设有控制通道，所述的微流控芯片包括PDMS本体，所述的TOMS本体的中央设有进样口，所述的检测通道和控制通道分别与进样口相连，所述的进样通道的末端和控制通道的末端均设有出口，所述的进样通道和控制通道内均设有多个柱状的凸起；所述的微流控芯片设置在一可旋转的转盘上，通过旋转转盘使待测样品、缓冲溶液、荧光纳米探针进入检测通道中。
【专利摘要】本发明公开了一种荧光纳米探针，包括内部载有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS纳米内核，所述的TEOS纳米内核表面修饰有多层表面键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS壳层。本发明的目的在于提供一种光信号强、有助于高通量检测食品中危险因子的荧光纳米探针，同时，本发明还提供了该荧光纳米探针的制备方法，以及采用该荧光纳米探针来实现食品中多种危害因子同步检测的方法。
【IPC分类】G01N33/533, G01N33/543
【公开号】CN105510574
【申请号】CN201510833301
【发明人】张恒, 易长青, 林燕奎, 刘慧玲
【申请人】深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心, 中山大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月25日