抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种定量检测人血清、血浆中抗磷脂酶A2受 体抗体IgG的酶联免疫分析试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 膜性肾病按发病原因可分为特发性和继发性膜性肾病，其诊断上要依靠临床表 现，肾脏穿刺术的组织学检查或肾组织电镜检查。肾脏穿刺术是一种侵入式的诊断方法，对 病人有一定的伤害;肾组织电镜检测对设备要求很高，难以普及使用。2009年国外首次报道 了特发性膜性肾病的自身免疫基质，其实质是自身抗体与磷脂酶A2受体反应的结果。磷脂 酶A2受体是在人肾小球足细胞表面表达，参与调节细胞中磷脂酶的结合过程。目前已经确 认了磷脂酶A2受体是自身抗体的主要靶抗原，研究发现约75%的特发性膜性肾病患者可以 通过血清学检测检出抗PLA2R抗体，国内也有文献显示在国人中检测阳性率更高，达到 82%，而继发性膜性肾病及其他类型肾小球疾病患者的检出率很低，健康人群均为阴性。血 清学PLA2R抗体的定量检测可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。因此， 开发非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的PLA2R定量测定试剂盒有极其重要的意义。
[0003] 目前报道的抗磷脂酶A2受体抗体检测技术主要有免疫印迹法、间接免疫荧光法和 时间分辨荧光法。免疫印迹法还在实验室研究阶段，主要在进行与组织病理学检测方法的 对比试验研究，方法的灵敏度、特异性相对较低；间接免疫荧光法，其采用转染的细胞作为 基质检测抗磷脂酶A2受体抗体，阳性样本的结果有荧光出现，阴性则无，属于定性检测方 法，不能精确的进行不同阶段的抗体滴度定量比较;时间分辨荧光法相对较复杂，需要时间 分辨荧光的专门检测仪器，试剂成本高，正处于研究阶段。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，为了提高磷脂酶A2受体抗体检测的灵敏度、特异性，能够定量检测且试 剂成本低，简单，操作简便的方法，本发明提供一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒及检测 方法。
[0005] 本发明是基于免疫反应和酶促反应，能够检测人血清、血浆样本中的磷脂酶A2受 体抗体IgG的含量，其测定原理是利用重组的磷脂酶A2受体抗原包被微孔板，用含0.5-5% 的BSA封闭液封闭，干燥，然后分别加入校准品和样品，其中抗磷脂酶A2受体抗体IgG与包被 在微孔板的抗原特异性结合，未结合的成分跟过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG抗体，进 行第二次结合反应，结果洗涤去除过量的HRP标记的抗人IgG抗体，加入3，3'，5，5'-四甲基 联苯胺(TMB)，在HRP的催化下显色，最后加入终止剂，显色的深浅与样品中的待测物含量成 比例，在酶标仪上进行450/630nm双波长检测。按照校准品对应的0D值做标准曲线，即可由 标准曲线算出各样本中抗磷脂酶A2受体抗体I gG的浓度值。
[0006] 酶联免疫吸附试验(ELISA)，其原理是酶分子与抗体或抗抗体共价结合，酶标记抗 体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。加入底物液后，底物可在酶作用 下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物 的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈 正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗 原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA法 对试剂的要求低，成本低，且能够定量检测，作为一种灵敏度高，可定量，能够替代价格昂贵 的进口试剂和其他复杂的检测系统而言，是一种临床实验室理想的检测方法。
[0007] 本发明解决其技术问题，所采用的技术方案是提供一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG 试剂盒及检测方法，所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒内设置有预包被重组人磷脂酶A2 受体抗原的微孔板，以及瓶装的以下试剂:一组抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品，阳性对照， 阴性对照，浓缩洗涤液，样本稀释液，酶标液，底物液和终止液。
[0008] 试剂盒各组分制备方法如下：
[0009] 预包被抗原微孔板的制备：将重组的人磷脂酶A2受体全分子或其片段，用浓度 0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液按1:50-1:1000稀释，所述碳酸盐缓冲液含0.159g Na2C03,0.293g NaHC03和1000ml H20,按照每孔100μΙ包被，在4°C过夜包被。之后弃去包被 液，洗涤3次，每孔再加入150μ1的稳定剂，所述稳定剂是磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液基质， 其中含0.5-5 %的BSA或酪蛋白，0.1-5 %的蔗糖或海藻糖，0.01-0.5 %的Procl in300，室温 孵育15min-4h，弃去稳定剂，干燥，放入铝箱袋封口后4°C保存。
[0010]所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品是由校准品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体 IgG阳性血清配制而成，各校准品浓度分别为2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ ml，每瓶中分装lml。
[0011] 所述阳性对照是由质控品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阳性血清配制而成； 阴性对照是由质控品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阴性血清配制而成。
[0012] 所述浓缩洗涤液的配制：按每升水中，12.11g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5ml的吐 温20,调pH 7.8,定容1L，即浓缩洗涤液。
[0013] 所述样本稀释液的配制：按每升水中，1.21g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.02-2g的 牛血清白蛋白（BSA)，0.5ml的吐温20，调pH 7.8，定容1L，即样本稀释液。
[0014]所述酶标液是由酶标记的抗人IgG抗体与酶标稀释液按合适浓度配制而成。所述 的酶为辣根过氧化物酶(HRP);根据所选用的酶标类型，底物为3,3' 四甲基联苯胺 (TMB)显色底物。终止液为0.25-2mol/L的硫酸或氢氧化钠。我们优选的终止液为lmol/L的 硫酉支。
[0015] -种抗磷脂酶A2受体抗体IgG的检测方法，包括以下步骤：
[0016] ①样本孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的微孔内分别加入一组校准 品，阳性对照与阴性对照，以及稀释后的待测样本各100μΙ，室温孵育30分钟；
[0017] ②一次洗涤:甩掉反应液，每孔用300μ1稀释10倍的浓缩洗涤液洗3次，拍干；
[0018] ⑧酶结合物孵育:在预包被人磷脂酶Α2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入酶标 液100μΙ，室温孵育30分钟；
[0019] ④二次洗涤:甩掉反应液，每孔用300μ1稀释10倍的浓缩洗涤液洗3次，拍干；
[0020] ⑤底物孵育：在预包被人磷脂酶Α2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入底物液 100μΙ，室温孵育10分钟；
[0021]⑥终止:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入终止液lOOul， 混匀；
[0022]⑦读值:加入终止液30分钟内将微孔板至于酶标仪上，用450/630nm双波长检测得 到各样本的0D值;按照校准品对应的0D值做标准曲线，将样本的0D值带入标准曲线中，计算 得到样本中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的浓度值。
[0023]有益效果:本发明是对抗磷脂酶A2受体抗体IgG进行定量检测，量值更易于临床上 的应用，便于比较治疗前后，病程周期病情的变化，定量优于定性的方法。另外，几乎所有类 型的医院都有ELI SA试剂配套使用的酶标仪，容易推广使用，能够解决目前临床的迫切需 求;另外相比其他复杂的检测系统而言，操作便利，是一种临床实验室理想的检测方法。同 时，ELISA法对试剂的要求低，成本低，能够替代价格昂贵的进口试剂，降低检测成本。该试 剂盒非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的定量检测血清、血浆和全血中的PLA2R抗体 含量，可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。
[0024]以下将结合附图和实施例，对本发明进行较为详细的说明。
【附图说明】
[0025]图1为本发明经典的校准曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明公开了 一种定量检测人血清、血浆中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的酶联免疫 分析试剂盒及检测方法，本领域的技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特 别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域的技术人员来说是显而易见的，它们都 被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已通过较佳实例进行了描述，相关人员明显 能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组 合，来实现和应用本发明技术。
[0027] 本发明提供抗磷脂酶A2受体抗体IgG酶联免疫分析试剂盒及检测方法中所用的生 物材料及试剂均可由市场购得。
[0028] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0029] 一、包被微孔板的制备方法：
[0030]利用重组的人磷脂酶A2受体全分子或其片段，用浓度0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐 缓冲液按1: 50-1:1000稀释，其中，碳酸盐缓冲液由0.159g Na2C03，0.293g NaHC03和 1000ml H20配置而成，每孔加入100μΙ稀释后的重组的人磷脂酶A2受体全分子或其片段进 行包被，在4°C过夜包被。之后弃去包被液，洗涤3次，之后每孔再加入150μ1的稳定剂，所述 稳定剂是磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液基质，其中含0.5-5 %的BSA或酪蛋白，0.1-5 %的蔗糖 或海藻糖，〇. 01-0.5 %的Procl in300，室温孵育15min-4h，弃去稳定剂，干燥，放入铝箱袋封 口后4°C保存。
[0031] 二、抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品制备方法：
[0032] 取临床上的阳性标本，经鉴定未检测出传染源的样本，多支混合，灭活、过滤、分 装，-40°C以下深冷保存。根据GB/T 21415-2008国家标准(体外诊断医疗器械生物样品中量 的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性)并结合临床实践确定了校准曲线的浓度点 分别为2冊/1111、20肋/1111、80肋/1111、400肋/1111、16001?1]